Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך
Summary
שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.
Abstract
הפתרון האולטימטיבי עבור חולים עם אי ספיקת לב בשלב הסופי הוא ניתוח השתלה. אבל תורם לבבות מוגבלים, החיסוני נדרש, בסופו של דבר דחייה יכולה להתרחש. יצירת פונקציונלי, לב ביו-מלאכותי עצמיים יכול לפתור אתגרים אלה. Biofabrication מלב מורכבת לגרדום ותאים היא אפשרות אחת. לפיגום טבעי עם הרכב רקמות ספציפיות, כמו גם מיקרו-מאקרו-אדריכלות ניתן להשיג על ידי לבבות decellularizing של בני אדם או חיות גדולות כמו חזירים. Decellularization כרוך שוטף פסולת הסלולר תוך שימור מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד של להערכת ומאפשר “cellularization”-timepoint מאוחר יותר. ניצול את הרומן שלנו למצוא את decellularization זלוף של איברים מורכבים אפשרי, אנחנו פיתחנו שיטה “פיזיולוגיים” יותר decellularize לבבות אנושיים שאינם שיפותחו על-ידי הצבתם בתוך נרתיק מווסת, ב הפוך כיוון, תחת לחץ מבוקר. המטרה של שימוש נרתיק בלחץ היא ליצור לחץ מעברי צבע על פני שסתום אבי העורקים שיישאר סגור ושיפור זלוף שריר הלב. הערכה בו זמנית של דינמיקת זרימת פסולת הסלולר הסרת במהלך decellularization אפשרה לנו לעקוב אחר תזרים נוזלים וגם יצוא פסולת, ובכך יוצר לפיגום שניתן המשמש לתיקון הלב פשוט (למשל ככתם או שסתום לגרדום) או בדומה לפיגום איברים שלמים.
Introduction
אי ספיקת לב מוביל תמותה גבוהה בחולים. אפשרות הטיפול האולטימטיבי עבור אי ספיקת לב בשלב הסופי הוא מאפשר-השתלת. עם זאת, יש רשימת המתנה ארוכה עבור השתלת בשל המחסור תורם איברים, חולים הפנים שלאחר השתלת hurdles שנעים בטווח שבין החיסוני חיים ארוך ל עוגב כרונית דחייה1,2. הלבבות פונקציונלי בביו-הנדסה לאכלס מחדש decellularized לבבות בגודל של האדם עם עצמו של החולה תאים יכול לעקוף מכשולים אלה3.
צעד חשוב “הנדסה” הלב הוא הקמת לפיגום עם מבנה כלי הדם ואת parenchymal המתאים, הרכב ותפקוד להנחות את היישור וארגון של תאים למשלוח. בנוכחות המסגרת המתאימה, תאים נזרע על הגרדום צריך לזהות את הסביבה ולבצע הפונקציה הצפוי כחלק האיבר הזה. לדעתנו, מטריצה חוץ-תאית איברים decellularized (dECM) כוללת את המאפיינים הדרושים של לגרדום אידיאלי.
על ידי ניצול להערכת מהותי, מורכב כולו אורגן decellularization יכולה להיות מושגת באמצעות תמיסה לשיתוק או זלוף רטרוגרדית4 כדי להסיר את מרכיבי התא תוך כדי שמירה על עדין מטריצה חוץ-תאית 3D ולהערכת2, 5,6,7. להערכת תפקודית חשוב בביו-הנדסה כל האיברים רק ויוו, חלוקת מזון, פינוי פסולת8. זלוף כלילית decellularization הוכח כיעיל ביצירת לבבות decellularized חולדות4או חזירים4,7,9,10,11 12, ,13ו בני5,7,14,15,16. ובכל זאת, שלמות של המסתמים, אטריה אזורים “דק” אחרים עלולים לסבול.
ניתן להשיג לב decellularized בגודל אדם פיגומים חזירים באמצעות הלחץ הבקרה7,9,10,11,12 או אינפוזיה תזרים קצב שליטה13, 17 מתורמים האנושי באמצעות לחץ לשלוט5,7,14,15. Decellularization לבבות אדם התורם מתרחשת במשך 4-8 ימים בלחץ נשלטת על 80-100 מ מ כספית התמצאות זקוף5,15,16 או במשך 16 ימים בלחץ נשלטת על 60 מ מ כספית14 . תחת תמיסה לשיתוק, שבשליטת הלחץ decellularization, כשירות שסתום אבי העורקים ממלא תפקיד מכריע בשמירה על יעילות זלוף כלילית ובלחץ יציב בספריית הבסיס של אבי העורקים. העבודות הקודמות שלנו גילה כי הכיוון של הלב השפעות ביעילותה זלוף כלילית במהלך ההליך decellularization ולכן שלמות לגרדום ב סוף9.
כהמשך של העבודה הקודמת שלנו9, אנחנו מציגים קונספט שבו נרתיק דמוי קרום הלב נוסף כדי לשפר את decellularization לב-שלם. אנו מתארים את decellularization של לבבות אדם הניח בתוך שקיות מווסת, בכיוון הפוך, ותחת לחץ מבוקר-120 מ מ כספית בסיס אב העורקים. פרוטוקול זה כולל ניטור פרופיל זרימה של אוסף המדיה יצוא לאורך כל ההליך decellularization כדי להעריך את יעילות זלוף כלילית והסרה פסולת תא. מבחני הביוכימי מבוצעות ואז לבחון את יעילות השיטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לידע שלנו, זהו המחקר הראשון decellularization ח הפוכה של לבבות אדם בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בצילום מואץ של קצב זרימה והסרת הלכלוך תא. נרתיק דמוי קרום הלב שומרת את הכיוון של הלב יציב לאורך כל ההליך decellularization. השוקע, היפוך את ליבם שלם בתוך נרתיק מונע התייבשות וצמצום עומס יתר על העורקים (מתוך הלב משקל) ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המענק יוסטון הקרן והקרן טקסס המתעוררים טכנולוגיה. המחברים להכיר איברים רכש סוכנות LifeGift, inc. ומשפחות של התורם עבור ביצוע מחקר זה אפשרי.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
Referenzen
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
