Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III)
Summary
Die Protokolle für das Studium der Bindung von gold-Kationen (Au(III)) zu verschiedenen Konformationen der Rinderserumalbumin (BSA) wie auch für die Charakterisierung der Konformationsänderungen abhängigen einzigartige BSA-Au Fluoreszenz dargestellt werden.
Abstract
Die vorgestellten Protokolle soll den Prozess der Au(III) Bindung an die BSA, nachgiebig Konformation bedingte rote Fluoreszenz (λEm = 640 nm) der BSA-Au(III)-komplexe. Die Methode stellt den pH-Wert zu zeigen, dass die Entstehung der rote Fluoreszenz mit der pH-induzierte Gleichgewicht Übergänge von der BSA Konformationen korreliert ist. Rot fluoreszierende BSA-Au(III)-komplexe können nur mit einer Einstellung des pH-Wertes bei oder über 9,7, das entspricht der “A-Form” Konformation der BSA gebildet werden. Das Protokoll die BSA, Au Molverhältnis anpassen und den zeitlichen Verlauf des Prozesses der Au(III) Bindung zu überwachen ist beschrieben. Die minimale Anzahl von Au(III) pro BSA, der rote Fluoreszenz zu produzieren ist weniger als sieben. Wir beschreiben das Protokoll in Schritten, um das Vorhandensein von mehreren Au(III)-Bindungsstellen im BSA zu veranschaulichen. Erstens, durch Zugabe von Kupfer (Cu(II)) oder Nickel (Ni(II)) kationen gefolgt von Au(III), zeigt diese Methode eine Bindungsstelle für Au(III), die nicht das rote Fluorophor. Zweitens wird durch BSA von Thiol Deckelung Agenten ändern, ein anderes Nonfluorophore bilden Au(III) Bindungsstelle aufgedeckt. Drittens sind ändern die BSA-Konformation durch Spaltung und Begrenzung der Disulfid-Bindungen, die mögliche Au(III) Bindung Webseite(n) illustriert. Das Protokoll beschrieben, zur Steuerung der BSA Konformationen und Au(III) Bindung, kann in der Regel angewendet werden, um die Wechselwirkungen von anderen Proteinen und Metallkationen zu studieren.
Introduction
Eine BSA-Au-Verbindung Ausstellen einer Ultraviolett (UV)-leicht erregbaren rote Fluoreszenz, mit bemerkenswerten schürt Verschiebung, wurde ursprünglich von Xie Et al.synthetisiert worden. 1. einzigartige und stabile rote Fluoreszenz finden Sie verschiedene Anwendungen in den Bereichen Fernerkundung,2,3,4, bildgebenden5,6,7oder Nanomedizin8 ,9,10,11,12,13. Diese Verbindung wurde von vielen Forschern auf dem Gebiet der Nano-Wissenschaft in den letzten Jahren14,15,16ausgiebig untersucht. Die BSA-Au-Verbindung wurde als Au25 nanocluster interpretiert. Das Ziel der vorgestellten Methode ist, diese Verbindung im Detail zu untersuchen und zu verstehen, die Herkunft der rote Fluoreszenz. Den vorgestellten Ansatz folgend können das Vorhandensein von mehreren Au Bindungsstellen, und die Herkunft der Fluoreszenz, Alternative zu einem Standort Nukleation von Au25 nanocluster dargestellt werden. Der gleiche Ansatz kann eingesetzt werden, zu studieren, wie andere Proteine17,18,19 komplexiert mit Au(III) ihren fluoreszierenden Eigenschaften ändern können.
Die Synthese der BSA-Au rot fluoreszierende Verbindung erfordert eine enge Kontrolle über das molare Verhältnis von BSA, Au (BSA:Au), die Intensität der Fluoreszenz und die Lage der Gipfel der Erregung-Emission Karte (EEM)20zu maximieren. Es kann gezeigt werden, dass mehrere Bindungsstellen für Au(III) zu binden, gibt es einschließlich der Asparagin-Fragment (oder Asp-Fragment, die ersten vier Aminosäurereste am N-Terminus des BSA)21,22. Die 34th Aminosäure der BSA (Cys-34) zeigt sich auch, Au(III) zu koordinieren und in den Mechanismus der roten fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20einbezogen werden. Auf alle Cys-Cys-Disulfid-Bindungen zu Spalten und verschließen alle Thiole, rote Fluoreszenz ist nicht produziert ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Dies weist auf die Notwendigkeit der Cys-Cys Disulfid Anleihen als die Au(III)-Bindungsstelle, die rote Fluoreszenz zu produzieren.
Protein-Chemie-Techniken haben nicht weit verbreitet, um die BSA-Au(III)-komplexe in der Nano-Science-Community zu studieren. Allerdings wäre es wertvoll, um diese Techniken zu verstehen, bestimmte Aspekte dieser komplexe, Detailwissen über die Au(III)-Bindungsstellen im BSA zu gewinnen. Dieser Artikel soll einige dieser Techniken zu zeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die BSA-Au(III) Verbindungen vorbereitet bei pH 12 weisen rote Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge λEm= 640 nm bei Erregung mit ultravioletten (UV) Licht λex= 365 nm (Abbildung 1A). Die Entstehung der rote Fluoreszenz ist ein langsamer Prozess und dauert ein paar Tage bei Raumtemperatur bis zu einer maximalen Intensität zu erhöhen. Läuft die Reaktion bei 37 ° C wird die optimale Ergebnisse liefern, obwohl höherer Temperatur verwendet werden kann,…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E anerkennt die Unterstützung von Duke Stiftungsfonds besondere Initiative, Wells Fargo Fonds, PhRMA Stiftung sowie Startup-Fonds von der University of North Carolina, Charlotte.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
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