Gold(III)의 바인딩에 의해 소 혈 청 알 부 민의 다양 한 Conformations에 Luminophore 형성

Summary

골드 양이온 (소 혈 청 알 부 민 (BSA) 구조적 종속 독특한 BSA Au 형광 특성화에 관해서는 잘 제시의 다양 한 conformations 하 Au(III))의 바인딩 공부에 대 한 프로토콜.

Abstract

제시 프로토콜의 목적은 Au(III) 바인딩할 구조 변화 유도 빨간색 형광 저조한 BSA의 과정을 공부 하는 (λ_em = 640 nm) BSA-Au(III) 복합물의. 메서드를 사용 하면 pH 빨간색 형광의 출현을 BSA conformations의 pH 유도 평형 전환 연관 표시를 조정 합니다. 빨간 형광 BSA-Au(III) 단지는 pH 9.7, 이상 해당 BSA의 “양식” 나 란 하의 조정만 형성 수 있습니다. 누구나 어 금 니 비율을 BSA를 조정 하 고 Au(III) 바인딩 과정의 시간 과정을 모니터를 프로토콜 설명 되어 있습니다. 빨간 형광을 생산 하기 위해 BSA 당 Au(III)의 최소 수 미만 7 이다. 우리는 BSA에 여러 Au(III) 바인딩 사이트의 존재를 설명 하는 단계에서 프로토콜을 설명 합니다. 구리를 추가 하 여 첫 번째 (Cu(II)) 또는 니켈 (Ni(II)) 양이온 Au(III) 다음,이 방법을 보여준다 바인딩 사이트 빨간 fluorophore는 Au(III)에 대 한. 둘째, thiol 에이전트를 상한 하 여 BSA를 수정 하 여 다른 nonfluorophore 형성 Au(III) 바인딩 사이트가 드러났습니다. 셋째, 가능한 Au(III) 바인딩 사이트 고착 및 이황화 결합의 상한 BSA 구조 변경, 그림은. 프로토콜 설명, BSA conformations 및 Au(III) 바인딩을 제어 하는 다른 단백질 및 금속 양이온의 상호 작용을 공부 하 일반적으로 적용할 수 있습니다.

Introduction

BSA-Au 화합물 전시는 자외선 (UV)-놀라운와 고르기 빨간색 형광 shift 스톡 스, 시 외원래 합성. ¹. 고유 하 고 고정적 빨간 형광^2,3,4,^5,,67이미징 또는 nanomedicine^{8 감지 분야에서 다양 한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다 ,,910,11,,1213}. 이 화합물은 최근 몇 년 동안^14,,1516나노 과학의 분야에서 많은 연구자에 의해 광범위 하 게 공부 되었습니다 했다. BSA-Au 화합물 Au₂₅ nanoclusters로 해석 되었습니다. 제시 방법의 목표는 세부에서이 화합물을 확인 하 고 빨간 형광의 기원 이해를 이다. 제시 방법에 따라, 여러 Au 바인딩 사이트의 존재 그리고 형광, Au₂₅ nanoclusters의 단일 사이트 nucleation 대안의 기원 그림 될 수 있습니다. 동일한 접근은 다른 단백질^17,,1819 complexed Au(III)와 그들의 본질적인 형광 속성을 변경할 수 있습니다 어떻게 연구 하 사용할 수 있습니다.

레드-형광 BSA Au 화합물의 합성에는 au (BSA:Au) 여기 방출 지도 (EEM)²⁰에 봉우리의 위치는 형광의 강도 극대화 하는 BSA의 어 금 니 비율의 좁은 제어를 필요 합니다. 그것은 수 표시 여러 바인딩 사이트에 바인딩하려면 Au(III)에 대 한 존재는 아스파라긴 조각 (또는 Asp 조각, BSA의 N-말단에서 처음 4 개의 아미노산 잔류물)를 포함 하 여^21,22. BSA (Cys-34)의 34^번째 아미노산 Au(III)를 조정 하 고 레드 fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))²⁰의 구조에 참여 하는 것에 표시 됩니다. 모든 Cys Cys 이황화 결합을 고착 하 고 모든 thiols, 빨간색 형광 상한 시은 생산된 ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). 이 빨간 형광을 생산 하는 Au(III) 바인딩 사이트 Cys Cys 이황화 결합의 필요성을 나타냅니다.

단백질 화학 기법은 하지 널리 나노 과학 커뮤니티에서 BSA-Au(III) 단지 공부를 사용 되었습니다. 그러나, 그것은이 단지, 또한 BSA에서 Au(III) 바인딩 사이트의 상세한 이해로 특정 측면을 이해 하는이 기법을 채택 하는 귀중 한 것입니다. 이 문서는 이러한 기술 중 일부를 보여 것입니다.

Protocol

1입니다. 복잡 한 BSA-Au(III)의 합성 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 학년 물 5 mL 반응 유리병에서의 1 mL에 BSA의 25 mg을 디졸브.참고: 솔루션 분명 나타납니다. HPLC 학년 물에 5 m m의 농도에 금 (III) 염화 물 안내 (chloroauric 산)을 분해.참고: 솔루션 노란색 나타납니다. Chloroauric 산 성 솔루션이이 농도에서 준비는 BSA Au 비율 1시 13분의 발생 합니다. 어디의 농도와 chloroauric 산?…

Representative Results

BSA-Au(III) 복합물의 형광에서 관찰 되었다 하는 BSA의 본질적인 파란 형광의 변환 (λem = 400 nm) 빨간색 형광을 (λem = 640 nm) 평형 통해 pH 9.7에 대해 발생 합니다 전환 (그림 1)입니다. EEM BSA-Au(III) Au 어 금 니 비율에 다른 BSA에 그림 2에 표시 하 고이 데이터 어떻게 다른 여기 파장에서 같은 방출 파장을 생…

Discussion

PH 12에서 BSA-Au(III) 화합물 λ_그들의 방출 파장에 빨간색 형광을 전시 = 640 nm로 자외선 (UV) 빛 λ_전= 365 nm (그림 1A). 빨간 형광의 출현은 느린 과정이 고 최대 강도를 높이기 위해 실내 온도에 몇 일을 걸릴 것입니다. 37 ° C에서 반응 실행 높은 온도 빨리 빨간 형광을 생산 하 사용할 수 있습니다 최적의 결과 얻을 것 이다. 단백질의 돌이킬 수 없는 저하<sup c…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999%	Sigma-Aldrich	459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0%	Sigma-Aldrich	4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0%	Sigma-Aldrich	C4706
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Urea, 99.5%	Chem-Implex Int'l	30142
Phospate buffered saline (PBS)	Corning	MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830