تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتنقية البروتين اللاهوائية وتركيز البروتين اللاهوائية، وتوصيف الحركية اللاحقة باستخدام نظام قطب الأوكسجين. ويتضح الأسلوب استخدام الإنزيم دسب، إنزيم ديوكسيجيناسي الذي أكثر استقرارا ونشطة عند تنقيته وتخزينها في بيئة لا هوائية.
Abstract
يمكن قللت البروتينات حساسة للأكسجين، بما في ذلك تلك الإنزيمات التي تستخدم الأوكسجين كركيزة، الاستقرار عند تنقيته باستخدام أساليب تنقية الهوائية التقليدية. وتوضح هذه المخطوطة التفاصيل التقنية المعنية بعملية تنقية اللاهوائية، بما في ذلك إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة، والأساليب للفصل اللوني للعمود في مربع القفازات، والملحي البروتين قبل حركية. كما وصفت هي أساليب إعداد واستخدام قطب أكسجين القيام بتوصيف الحركية لأنزيم الاستفادة من الأكسجين. يتم توضيح هذه الأساليب باستخدام الإنزيم ديوكسيجيناسي دسب، ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6.
Introduction
الإنزيمات التي تستخدم الحديد أو المعادن الأخرى لتنشيط الأكسجين غالباً ما تكون عرضه للمنظمة خلال عملية التنقية بسبب إبعادهم من البيئة الحد من خلية. ولذلك، هذه البروتينات يجب استخدامه كخلية ليساتيس، والتعرض لعوامل خارجية الحد، أو يمكن تنقية لاهوائيا ضمان أن تكون لديهم النشاط الأنزيمي الأمثل1،2،،من34. لتلك الإنزيمات التي ضروري الأكسجين حساسة (الإنزيمات المحتوية على الحديد على وجه التحديد)، تنفيذ جميع الخطوات تنقية وتوصيف مع الحفاظ على الظروف اللاهوائية الكامل لتوصيفها. وقد أدى هذا الباحثين تطوير الهياكل مختبر كامل في حدود الدوائر اللاهوائية لدراسات تتراوح بين التعبير البروتين من خلال البلورات5،،من67،8 .
هنا، نحن التقرير أساليب لتنقية اللاهوائية والحركية توصيف الإنزيم دسب باستخدام نظام قطب الأوكسجين. دسب هو ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6 التي تتصل ليجاب، ديوكسيجيناسي بروتوكاتيكواتي من الكائن نفسه. كلا الإنزيمات تنتمي إلى النوع الثاني بروتوكاتيتشواتي ديوكسيجيناسي (بكاد) فوق عائلة التي لم تدرس على نطاق واسع بتاريخ9، يحتمل جزئيا بسبب الإنزيمات من فوق عائلة هذا يجري عرضه للمنظمة عند تنقيته باستخدام معيار الهوائية طرق تنقية البروتين. منذ عرض بعض الإنزيمات بكاد المجون الركازة البعض الآخر الركيزة الخاصة2،10، كذلك وصف فوق عائلة هذا ضروري لتحديد المحددات خصوصية. كما لوحظ في عدة الإنزيم سوبيرفاميليس11،،من1213،،من1415، الجزيئات الصغيرة يمكن أن يغير النشاط عن طريق تثبيط المنافسة المباشرة أو ربط جزيئات منفصلة جيوب اللوستيريك مما يؤدي إلى زيادة أو نقصان في النشاط الأنزيمي16. وفي حين لا يمكن التفريق حركية وحدة موقع المغير، تحديد حجم تغير نشاط مهم لفهم الآثار ملزمة. كهذه، أساليب لتحديد الخصائص الحركية الأصلية ديسب النشاط ونشاطها بحضور 4-نيتروكاتيتشول (4NC)، مجمع شيوعاً لتوصيف وتمنع ديوكسيجيناسي الإنزيمات2،17، 18، وترد.
دسب غير قادرة على كسر يبيغاللوكاتيشين، مجمع، عن طريق فعل ديوكسيجيناسي (إيدو) اكستراديول في الطوق الذي فتح هو حفز استخدام الأوكسجين كواحدة من ال10،ركائز19عطرية المستمدة من اللجنين. يحدث هذا التفاعل الأنزيمي في سياق انهيار اللجنين، هيتيروبوليمير عطرية الموجودة في جدار الخلية من النباتات. يمكن أن يكون ديبوليميريزيد اللجنين، مما أسفر عن مجموعة متنوعة من المركبات العطرية يمكن كذلك تقسيمها إلى نواتج الأيض وسط3،،من2021،22،23،24 ،25،،من2627،،من2829،30،31،32،33 . اكستراديول ديوكسيجيناسيس (إيدو) تحفيز عصابة فتح رد فعل على المركبات العطرية ديهيدروكسيلاتيد، حيث يحدث انشقاق المتاخمة ديول نسق المعادن؛ وفي المقابل، تنشق ديوكسيجيناسيس إينتراديول المركبات العطرية المماثلة بين مجموعتي هيدروكسيل (الشكل 1). وقد عدس، مثل العديد من ميتالوينزيميس الأخرى، مركز ديفالينت لمعادن لتنسيق Fe(II) تتألف من اثنين–الحامض الأميني، واحد-كاربوكسيلات ثالوث9،،من3435. تصبح تتأكسد هذه ميتالوينزيميس، من خلال autoxidation أو تستند إليه المنظمة، في حين يتم تقديم الإنزيم غير نشط2،36،،من3738.
في الإجراءات التجريبية المبينة في هذه المخطوطة، فنحن نستخدم دسب، عضو فوق بكاد عائلة من بكتيريا سفينجوبيوم sp. SYK-6، تحفيز إضافة الأكسجين عبر رباط C4-C5 يبيغاللوكاتيشين (الشكل 2A). ريجيوتشيميستري هذا الانقسام يناظر ليجاب، وبروتوكاتيتشواتي-4، 5-ديوكسيجيناسي (الشكل 2). وحتى الآن، تشمل التحقيقات في هذه ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين أي تقارير عن المركبات التي تمنع دسب10،،من1939. باستخدام أساليب تنقية الهوائية، عرضت دسب النشاط المتغير، بينما مع استخدام الأساليب اللاهوائية كنا قادرين على استمرار الحصول على البروتين مع النشاط استنساخه. وتبين الدراسات الحركية الموصوفة هنا أساليب تنقية اللاهوائية دسب، توصيف الحركية لرد فعل دسب مع يبيغاللوكاتيشين، وتثبيط دسب قبل 4-نيتروكاتيتشول (4NC).
Protocol
Representative Results
Discussion
تشمل الخطوات الحاسمة في الحصول على بروتين دسب النشطة، وتنقية في تشكيل والحفاظ على الموقع النشط Fe(II) انخفاض في الإنزيم. على هذا النحو، تصحيح أداء التعريفي، وتنقية، والتركيز، والملحي خطوات ضرورية لنجاح الحصول على نشاط إنزيم. حمل التعبير البروتين حضور كبريتات الأمونيوم الحديدية 1 مم يضمن إد?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور كاميل كيلر من جامعة ويسليان للدعم التقني. خاص بفضل البروفسور ليندساي دال Eltis وجينا ك. كابيك من جامعة كولومبيا البريطانية، فضلا عن المسيحية ويتمان من جامعة تكساس في أوستن، لمشورتهم فيما يتعلق بأساليب تنقية البروتين اللاهوائية واستخدام يا2 –القطب الحساسة.
Materials
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
Referenzen
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemie. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemie. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemie. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemie. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemie. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
