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Biochemie

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB より安定し、精製し、嫌気性環境で保存されているときにアクティブであるジオキシゲナーゼ酵素酵素を用いた方法を示します。

Abstract

これらの酵素は、基質として酸素を利用するを含む酸素感受性タンパク質は伝統的な有酸素浄化メソッドを使用して精製した際の安定性が減少します。この原稿は、グローブ ボックスと反応速度論の前に蛋白質の脱塩でバッファーおよび試薬のカラム ・ クロマトグラフィ法の準備を含む嫌気性精製プロセスに関与する技術的な詳細を示しています。準備および酸素電極を使用して酸素を利用した酵素の速度論的解析を実行するためのメソッドは、述べる。これらのメソッドは、ジオキシゲナーゼ酵素細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK 6 から没食子酸ジオキシゲナーゼ DesB を使用して説明します。

Introduction

鉄や他の金属には活性酸素を利用する酵素は、それらの除去のため細胞の還元環境から浄化プロセス中に不活化を受けやすい。したがって、これらの蛋白質はセル lysates として使用する必要があります、外部の還元剤にさらされるまたは最適な酵素活性1,2,3,4があるように嫌気浄化されます。これらの酵素は酸素感受性 (具体的には鉄を含む酵素)、嫌気的条件を維持しながらすべての精製と諸性質の手順を実行するそれらを完全に特徴づける必要です。これは、嫌気性チャンバー結晶5,6,7,8 を介してタンパク質発現に至る研究の範囲内で全体の研究室のセットアップを開発する研究者をつながっています。.

ここで、嫌気性の精製と酵素酸素電極を用いた DesB の速度論的解析法を報告する.DesB は、没食子酸ジオキシゲナーゼ細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK-6 LigAB、同じ有機体から protocatecuate ジオキシゲナーゼに関連しているからです。日9、好気性の標準を使用して精製した場合不活化を受けやすいこのスーパーファミリーの酵素の一部可能性がありますに広範囲に研究されていないタイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する両方の酵素蛋白質の浄化方法。PCAD 酵素のいくつかはありますが基質特異的2,10, 基板混乱を表示からさらにこのスーパーファミリーの特性評価は特異性の決定要因を識別するために必要です。小さな分子が直接競争の阻害を介して活動またはのバインディングを変更できますいくつか酵素ガ11,12,13,14,15で確認されています別のアロステリック ポケットが増加または減少酵素活性16する分子。速度だけでは、変調器の結合場所を区別できない、効果を理解するために重要なは活動変化の大きさを決定します。このような DesB のネイティブ アクティビティおよびその活動 4-nitrocatechol (4NC) を特徴付けるジオキシゲナーゼ酵素2,17,を抑制する一般的に使用される化合物の存在下での速度論的解析法18日が表示されます。

DesB は、リグニン由来芳香族化合物、基板10,19の一つとして酸素を使用して開口部を触媒するリングで extradiol ジオキシゲナーゼ (江戸) 反応による没食子酸を分解することができます。この酵素反応は芳香族 heteropolymer は、植物の細胞壁のリグニン分解のコンテキスト内で発生します。リグニンを depolymerized することができます、さまざまな芳香族化合物を降伏するさらに分けることが中央代謝物3,20,21,22,2324, ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江戸) を触媒、胸の谷間が金属配ジオール; に隣接して発生する dihydroxylated 芳香族化合物の反応を開環対照的に、intradiol dioxygenases は、2 つのヒドロキシル グループ (図 1) と芳香族化合物類似を切断します。他の多くの酵素のような EDOs 2 ヒスチジン 1-カルボン酸トライアド9,34,35から成る調整鉄 (ii) の二価金属センターがあります。これらの酵素は、酵素が非アクティブな2,36,37,38を表示されるに対し自動酸化、不活性化のメカニズムに基づくと酸化になります。

本稿では、実験手順では、DesB、没食子酸 (図 2 a) の C4 C5 結合に酸素の付加を触媒する細菌Sphingobium sp. SYK-6 から PCAD スーパーファミリーのメンバーを利用します。この胸の谷間の regiochemistry は、プロトカテク酸–4, 5-ジオキシゲナーゼ (図 2 b) は、LigAB に似ています。これまでのところ、この没食子酸ジオキシゲナーゼの調査は、DesB10,19,39を阻害する化合物のレポートを含めません。有酸素浄化方法の使用は、DesB では、変数の活動を嫌気的方法の使用に一貫して再現可能なアクティビティとタンパク質を取得することができました、出展しました。ここで説明した動力学的研究 DesB、没食子酸と DesB の反応と 4-nitrocatechol (4NC) による DesB の阻害の速度論的解析の嫌気性の浄化メソッドに示します。

Protocol

1. 一般材料と方法 表 1に示すようにすべての必要なメディアを準備します。15 分無菌 120 ° C のオートクレーブは、0.2 μ m フィルターを通過して MgCl2とグルコースの添加後 SOC ソリューションをフィルターします。オートクレーブに入れる前にミラーのホストゲノム スープ (LB 媒体) 溶液の pH を調整します。0.2 mM、0.1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩タンパク質発現と溶?…

Representative Results

DesB マルトース結合タンパク質 (MBP) 融合コンストラクト (図 3) の精製から個々 の分数の SDS ページのゲルの分析は、示されています。ゲルを明らかにタンパク質が純粋である (MW = 91.22 kDa)、DesB の存在を除いて (MW = 49.22 kDa) と MBP タンパク質ドメイン (42 kDa) をお互いから切断します。分数 E2 および E3 は、濃度 (ステップ 4.2) に選ばれました。 …

Discussion

アクティブな精製された DesB タンパク質を得ることに重要なステップは、形成と酵素の減らされた鉄 (ii) アクティブ サイトの維持を含みます。よう、誘導、浄化、集中、パフォーマンスを修正し、脱塩の手順は活性酵素を正常に取得に欠かせない。1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩の存在下でタンパク質の発現を誘導する鉄 (ii) は DesB の活性部位に正しく組み込まれてことを保証します。このメ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

テクニカル サポートのウェスリアン大学の博士カミーユ ・ ケラーに感謝したいと思います。嫌気性蛋白質精製方法および O2 の使用に関する彼らのアドバイス教授リンゼイ + Eltis、ジェナ ・ k ・ Capyk ブリティッシュ ・ コロンビアの大学から、テキサス大学オースティン校からキリスト教ホイットマンのおかげで特別な-電極。

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
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Referenzen

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Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
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