Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.

Abstract

Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.

Introduction

Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität^1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakteri....

Protocol

1. Allgemeine Materialien und Methoden

1. Bereiten Sie die erforderlichen Medien, wie in Tabelle 1beschrieben. Autoklaven bei 120 ° c für 15 min. Steril filtern die SOC-Lösung nach Zugabe von MgCl₂ und Glukose, indem man es durch einen 0,2 µm-Filter. Stellen Sie den pH-Wert des Müllers Lysogeny Brühe (LB Medien) Lösung vor dem Autoklavieren. Ergänzen Sie die LB-Amp-Media-Lösung nach dem Autoklavieren mit sterilen Lösungen von 0,2 mM L-Cystein, dann 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat, Proteinexpression und Löslichkeit zu verbessern.
2. Bereiten Sie die Laemmli-Puffer und laufenden Puffer für Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), wie....

Results

Gezeigt wird die SDS-PAGE Gelanalyse der einzelnen Fraktionen von Reinigung des DesB-Maltose Binding Protein (MBP) Fusion Konstrukts (Abbildung 3). Das Gel zeigt, dass das Protein pur (MW = 91.22 kDa), mit Ausnahme der Anwesenheit von DesB (MW = 49.22 kDa) und MBP Protein-Domäne (42 kDa) voneinander gespalten. Brüche-E2 und E3 wurden für Konzentration (Schritt 4.2) ausgewählt.

Reproduzierbare Ergebn.......

Discussion

Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien wi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise	Gold Bio Technologies	I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	161-0400
Ammoniumpersulfat	Bio-Rad	161-0700
30% Acrylamid	Bio-Rad	161-0158
N,N'Tetramethyl-ethylendiamin	Bio-Rad	161-0801
Amylose-Harz High Flow	New England Biolabs	E8022S
BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli-Zellen	New England Biolabs	C2527I
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Gallussäure	Sigma Aldrich	G7384
4-Nitrocatechol	Sigma Aldrich	N15553
Eisen Ammoniumsulfat	Mallinckrodt	5064
Natriumdithionit	Alfa Aesar	33381-22
Wheaton Serumflaschen	Fisher Scientific	06-406G
25 mm Acrodisc PF Spritzenfilter mit Supor Membrane	Pall Corportation	4187
400 mL Amicon Rührzellenkonzentrator	EMD Millipore	UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa Cutoff-Filter für rekonstituierte Zellulosemembran	EMD Millipore	PLGC07610
DL-Dithiothreitol	Gold Bio Technologies	DTT50
Sephadex G-25 Grobentsalzungssäule	GE Healthcare	17-0033-01
2-ml-Bördelfläschchen	Fisher Scientific	03-391-38
Oxygraph Plus Elektrodensteuergerät	Hansatech Instruments	OXYG1 Plus
Sauerstoff-Eletrodenkammer	Hansatech Instruments	DW1
Elektrodenscheibe	Hansatech Instruments	S1
PTFE (0,0125 mmX25mm) 30m Rolle	Hansatech Instruments	S4
Elektrodenreinigungsset	Hansatech Instruments	S16
Abstandspapier	Zick-Zack	an jeder Tankstelle
He-Serie Dri-Lab Handschuhfach	Vakuum/Atmosphären Unternehmen
HE-493 Dri-Train	Vakuum/Atmosphären Unternehmen
Doppelseitiger mikrokonischer Edelstahlspatel	Fisher Scientific	21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Säule Economy Säule	Fisher Scientific	k420400-1530
10 μ L, Modell 701 N SYR, Zementiert NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2	Spritze Hamilton	80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Säule	Fisher Scientific	K420401-1505
Emulsiflex-C5 Hochdruck-Homogenisator	Avestin
zur vollständigen bakteriellen Proteinextraktion	Thermo Fisher Scientific	89821
Lysozym aus Hühnereiweiß	Sigma Aldrich	12650-88-3
Natriumdodecylsulfat	Thermo Fisher Scientific	151-21-3
Ampicillin	Sigma Aldrich	7177-48-2
Trypton	Fisher Scientific	BP-1421-500
Hefeextrakt	Fisher Scientific	BP1422-2
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271-10
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P217-3
Magnesiumchlorid	Fisher Scientific	M33-500
Dextrose	Fisher Scientific	D16-3
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S318-1
Trishydrochlorid	Fisher Scientific	BP153-500
Maltose	Fisher Scientific	BP684-500
Glycin	Fisher Scientific	G46-500