Summary

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Published: October 12, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Abstract

Eine einzelne Zelle Genexpression sondieren ermöglicht die Identifizierung von Zelltyp und Zellstatus. Einzelne Zelle RNA Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium transcriptional Profile der Zellen, vor allem in heterogenen Geweben wie das zentrale Nervensystem entstanden. Dissoziation-Methoden, die für die einzelne Zelle Sequenzierung erforderlich können jedoch auf experimentelle Veränderungen in der Gen-Ausdruck und Zelle Tod führen. Darüber hinaus sind diese Methoden in der Regel auf frischem Gewebe, wodurch Studien zur Archivierung und Bio-Bank Material beschränkt. Einzigen Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist eine attraktive Alternative für transkriptionelle Studien, da es genau identifiziert Zelltypen, erlaubt die Untersuchung von Gewebe, das gefrorene oder schwer zu distanzieren, und reduziert die Dissoziation-induzierte die Transkription. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Protokoll für schnelle Lokalisierung der Kerne für nachgeschaltete SnRNA-Seq. Diese Methode ermöglicht die Trennung der Kerne von frischen oder gefrorenen Rückenmark Proben und kann mit zwei parallelen Tröpfchen Kapselung Plattformen kombiniert werden.

Introduction

Das Nervensystem besteht aus heterogenen Gruppen von Zellen, in denen vielfältige morphologische, Biochemische und elektrophysiologische Eigenschaften angezeigt. Während die Masse RNA Sequenzierung nützlich für die Bestimmung der Gewebe-Änderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen wurde, schließt es die Erkennung von transcriptional Änderungen auf der Ebene der einzelnen Zelle. Jüngste Fortschritte in der einzelligen transkriptionelle Analyse konnten die Einteilung der heterogenen Zellen in funktionellen Gruppen anhand ihrer molekularen Repertoire und können auch genutzt werden, um Gruppen von Neuronen zu erkennen, die vor kurzem aktiv gewesen. 1 , 2 , 3 , 4 in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung der einzelnen Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq) die Untersuchung der Genexpression in Einzelzellen, bietet einen Blick in Zelltyp Vielfalt ermöglicht. 5

Die Entstehung der skalierbare Ansätze wie massiv parallelen ScRNA-FF, lieferte Plattformen zur Sequenz heterogene Gewebe, einschließlich viele Regionen des zentralen Nervensystems. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch einzelne Zelle Dissoziation Methoden Zelltod sowie experimentelle Veränderungen in der Genexpression führen. 16 neuere Arbeiten adaptierte Einzelzelle sequenziermethoden um Erhaltung der endogenen transcriptional Profile zu aktivieren. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 diese Strategien wurden besonders geeignet zur Erkennung von unmittelbaren frühen (IEG) Genexpression nach Sinnesreiz oder Verhalten. 3 , 4 In der Zukunft könnte diese Strategie auch verwendet werden, dynamische Veränderungen in den Geweben bei Krankheitszuständen oder in Reaktion auf stress zu studieren. Dieser Methoden einzelne Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist ein vielversprechender Ansatz, das beinhaltet keine Stress auslösende Zelle Dissoziation und kann verwendet werden, schwierig, Gewebe (z. B. das Rückenmark) zu distanzieren, sowie gefrorene Gewebe. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted von früheren Kerne Isolierung Methoden nutzt20,21,22,23,25 SnRNA-Seq in der Regel schnelle Gewebe Störungen und Zelle lyse unter kalten Bedingungen, Zentrifugierung und Trennung der Kerne von zelltrümmer. 4 Kerne für die nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation auf mehreren Plattformen in mikrofluidischen Tröpfchen Kapselung absperrbar. 4 , 7 , 24 , 25 diese Methode ermöglicht einen Überblick über die transkriptionelle Aktivität aus Tausenden von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt.

Es gibt mehrere Strategien für die Freigabe von Kernen von Zellen vor Isolation und Sequenzierung, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile. Hier beschreiben wir vergleichen zwei Protokolle zur Isolierung von Kernen aus dem Erwachsenen Rückenmark für die nachgelagerten massiv parallelen SnRNA-Seq ermöglichen: Waschmittel-mechanische Lyse und hypotone-mechanische Lyse. Waschmittel-mechanische Lyse liefert komplette Gewebe Störungen und eine endgültige Mehrertrag von Kernen. Hypotone Maschinenbau-Lyse enthält eine steuerbare Maß an Gewebe Störungen, bietet eine Möglichkeit für die Auswahl ein Gleichgewicht zwischen der Menge und Reinheit der letzten nuklearen Ausbeute. Diese Ansätze bieten vergleichbare RNA-Ausbeute, ermittelte Anzahl von Genen pro Kern und Zelltyp profiling und können auch beide verwendet werden erfolgreich für SnRNA-Seq.

Protocol

Alle tierische Arbeit wurde nach einem Protokoll genehmigt von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care und Use Committee durchgeführt. Ausgewogene Proben von männlichen und weiblichen ICR/CD-1 Wildtyp Mäusen, zwischen 8 und 12 Wochen alt, wurden für alle Experimente verwendet. Mäuse sollten in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Animal Care und Use Committee Richtlinien behandelt werden. 1. Vorbereitung von Materialien und Puffer Bereite…

Representative Results

Hier haben wir Isolierung der Kerne aus dem Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark für nachgeschaltete massiv parallelen RNA Sequenzierung durchgeführt. Das Protokoll beteiligten drei Hauptkomponenten: Gewebe Störungen und zellulären Lyse, Homogenisierung und Saccharose Dichte Zentrifugation (Abbildung 1). Innerhalb von Sekunden ergab die Waschmittel-mechanische Lyse eine grobe Kerne Vorbereitung mit einer großen Anzahl von Kernen sowie Mobilfun…

Discussion

Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist, Kerne mit qualitativ hochwertigen RNA für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu isolieren. Wir angepasst SnRNA-Seq Methoden um alle Zelltypen im Rückenmark zu profilieren. Zunächst fanden wir, dass typische Zelle Dissoziation Methoden für einzelne Zelle RNA Sequenzierung, unwirksam waren, wie Rückenmark Neuronen Absterben von Zellen besonders anfällig sind. Darüber hinaus verursachen Zelle Dissoziation Methoden Ausdruck der verschiedenen Aktivitäten und Stressa…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das intramurale Programm der NINDS (1 ZIA NS003153 02) und NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wir danken L. Li und CI Dobrott für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen und C. Käthe für die Überprüfung der Handschrift.

Materials

Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M1028-10X1ML
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100X) Gibco 35050-061
B27 (50X) Gibco 17504-044
1X PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 ml) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Corning 353002

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Matson, K. J., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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