Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.
Abstract
Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.
Introduction
El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas. 1 , 2 , 3 , 4 en los últimos diez años, el desarrollo de RNA de la célula única secuenciación (scRNA-Seq) ha permitido el estudio de la expresión génica en células individuales, proporcionando una visión en la diversidad de tipo de la célula. 5
La aparición de métodos escalables como tratamiento masivo en paralelo scRNA-Seq, ha proporcionado plataformas para tejidos heterogéneos de la secuencia, incluyendo muchas regiones del sistema nervioso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, métodos de disociación celular solo pueden llevar a la muerte celular así como los cambios experimentales en la expresión génica. 16 trabajo reciente ha adaptado métodos de secuenciación de unicelular para preservación de perfiles transcripcionales endógenos. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estrategias han sido particularmente convenientes para la detección inmediata temprana expresión del gen (IEG) después de estímulo sensorial o comportamiento. 3 , 4 en el futuro, esta estrategia podría también ser utilizada para estudiar los cambios dinámicos en los tejidos en Estados de enfermedad o en respuesta al estrés. De estos métodos, la secuencia solo núcleo RNA (snRNA-Seq) es un enfoque prometedor que implican estrés induce la disociación celular y puede ser utilizado en difícil de disociar del tejido (por ejemplo, la médula espinal), así como congelado tejido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de los métodos de aislamiento de los núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq típicamente utiliza el celular y la interrupción de tejido rápido lisis en condiciones de frío, centrifugación y separación de los núcleos de la ruina celular. 4 núcleos pueden ser aislados para la secuenciación de próxima generación descendente en múltiples plataformas de encapsulación de gotita de microfluidos. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite una instantánea de la actividad transcripcional de miles de células en un momento en el tiempo.
Existen múltiples estrategias para la liberación de los núcleos de las células antes de aislamiento y secuencia, cada uno con sus ventajas y desventajas. Aquí, describimos y comparar dos protocolos para permitir el aislamiento de los núcleos de la médula espinal adulta para el tratamiento masivo en paralelo abajo snRNA-Seq: lisis mecánica detergente y lisis hipotónica-mecánica. Lisis de detergente-mecánica proporciona la interrupción completa del tejido y un mayor rendimiento final de los núcleos. Mecánica-lisis hipotónica incluyen un grado controlable de disrupción del tejido, proporcionando una oportunidad para la selección de un equilibrio entre la cantidad y la pureza de la producción nuclear final. Estos enfoques proporcionan rendimiento comparable de RNA detectado un número de genes por núcleo y mediante perfiles tipo de la célula y también pueden tanto ser utilizados con éxito para snRNA-SS.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
Referenzen
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