Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.
Abstract
Sondando a expressão de gene de uma célula individual permite que a identificação do tipo de célula e estado da célula. A sequenciação do ARN monocelulares tem emergido como uma poderosa ferramenta para estudar perfis transcriptional de células, particularmente nos tecidos heterogêneos, tais como o sistema nervoso central. No entanto, métodos de dissociação necessários para sequenciamento única célula podem levar a mudanças experimentais na morte gene expressão e celular. Além disso, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, limitando assim os estudos sobre arquivamento e material de bio-banco. Sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma alternativa atraente para estudos transcricionais, dado que com precisão identifica os tipos de células, permite o estudo de tecido que é difícil dissociar, ou congelados e reduz induzida por dissociação transcrição. Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para isolamento rápido de núcleos para jusante snRNA-Seq Esse método permite o isolamento dos núcleos de amostras frescas ou congeladas da medula espinhal e pode ser combinado com duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota.
Introduction
O sistema nervoso é composto por grupos heterogêneos de células que exibem uma disposição diversa de propriedades morfológicas, bioquímicas e eletrofisiológicas. Enquanto o sequenciamento de RNA em massa tem sido útil para determinar todo o tecido alterações na expressão do gene em condições diferentes, isso impede a detecção de alterações transcricionais no nível de célula única. Avanços recentes na célula única análise transcricional permitiram a classificação de células heterogêneas em grupos funcionais com base em seu repertório molecular e ainda podem ser aproveitados para detectar conjuntos de neurônios que tinham sido recentemente ativos. 1 , 2 , 3 , 4 nos últimos dez anos, o desenvolvimento de uma única célula RNA sequenciamento (scRNA-Seq) permitiu o estudo da expressão do gene em células individuais, proporcionando uma visão sobre a diversidade do tipo de célula. 5
O surgimento das abordagens escaláveis como maciçamente paralelo scRNA-Seq, forneceu plataformas para tecidos heterogêneos de sequência, incluindo muitas regiões do sistema nervoso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 entretanto, métodos de dissociação única célula podem originar a morte celular, bem como alterações experimentais na expressão gênica. 16 trabalho recente adaptou-se métodos de sequenciamento única célula para permitir a preservação dos perfis transcriptional endógenas. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estratégias têm sido particularmente adequadas para a detecção imediata expressão de gene (IEG) inicial após estímulo sensorial ou comportamento. 3 , 4 no futuro, esta estratégia poderia também ser usada para estudar as mudanças dinâmicas nos tecidos nos Estados de doença ou na resposta ao estresse. Esses métodos, sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma abordagem promissora que não envolve a dissociação de células indutoras de stress e pode ser usada na difícil dissociar o tecido (por exemplo, a medula espinhal), bem como congelados tecido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de métodos de isolamento de núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq normalmente utiliza celular e ruptura rápida de tecido Lise sob condições de frio, centrifugação e separação dos núcleos de restos celulares. 4 núcleos podem ser isolados para o sequenciamento de próxima geração a jusante em múltiplas plataformas de encapsulamento de gotículas microfluidic. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite um instantâneo da atividade transcricional de milhares de células em um momento no tempo.
Existem várias estratégias para liberação de núcleos de células antes de isolamento e sequenciamento, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Aqui, descrevemos e comparar dois protocolos para permitir o isolamento dos núcleos da medula espinhal adulto para a jusante maciçamente paralelo snRNA-Seq: lise detergente-mecânica e lise hipotónica-mecânica. Lise de detergente-mecânica fornece tecido completo rompimento e um maior rendimento final de núcleos. Mecânica-lise hipotónica inclui um grau controlável de ruptura do tecido, proporcionando uma oportunidade para a seleção de um equilíbrio entre a quantidade e a pureza do rendimento final nuclear. Estas abordagens fornecem rendimento comparável do RNA, detectado um número de genes por núcleo e o tipo de célula de criação de perfil e também podem ser usados com sucesso para snRNA-Seq
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo final do presente protocolo é isolar núcleos contendo RNA de alta qualidade para análise transcricional a jusante. Adaptamos snRNA-Seq métodos para o perfil de todos os tipos de células na medula espinhal. Inicialmente, achamos que métodos de dissociação típica célula eram ineficazes para sequenciamento do RNA de única célula, como os neurônios da medula espinhal são particularmente vulneráveis à morte celular. Além disso, métodos de dissociação celular induzem a expressão de vários genes…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li e C.I. Dobrott pelo apoio técnico e discussões úteis e C. Kathe para revisar o manuscrito.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
Referenzen
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