Isolatie van CD4+ T-cellen en analyse van de circulerende T-folliculaire Helper (cTfh) cel Subsets van 6-kleur met behulp van perifere bloed stroom Cytometry
Summary
Hier, een protocol voor de isolatie en de karakterisering van CD4+ T-cel subsets van menselijke perifeer bloed wordt beschreven. CD4 gezuiverd+ T-cellen worden geanalyseerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van T-folliculaire helper cel subsets.
Abstract
Aberrant T-folliculaire helper (Tfh) cel activiteit kan worden opgespoord in auto-immune omstandigheden en hun aanwezigheid wordt geassocieerd met klinische resultaten wanneer de communicatie van de lymfeklier in de B-cel non-Hodgkin-lymfoom is geanalyseerd. Deelverzamelingen van circulerende folliculaire T helper cellen (cTfh), de circulerende geheugencompartiment van Tfh cellen in het bloed, ook bij ziekte worden verstoord en daarom vertegenwoordigen potentiële nieuwe voorspellende biomarkers. Perifere bloed gebaseerde testen is gunstig, want het is relatief niet-invasieve en zorgt voor de eenvoudige seriële opvolging. Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van CD4 T-cellen+ van menselijk bloed, en verdere analyse door stroom-cytometry bij het inventariseren van cTfh cellen en moet de mengverhouding van hun verschillende deelverzamelingen (cTfhPD-1-/ +/ hi, cTfh1, 2, 17 en cTfh1/17). Het niveau van deze deelverzamelingen werd vervolgens vergeleken tussen normale onderwerpen en patiënten met lymfoom. We vonden dat de methode robuust genoeg zijn was om betrouwbare resultaten te verkrijgen van routinematig verzamelde materiaal van de patiënt. De techniek die we voor de analyse beschrijven kan gemakkelijk worden aangepast aan de cel Sorteren en downstream toepassingen zoals RT-PCR.
Introduction
Folliculaire T helper cellen (Tfh) zijn een CD4+ T-cel-deelverzameling die aanvankelijk in1van de lymfoïde weefsels gekenmerkt werd. Deze cellen express PD-1 en CXCR5 oppervlak receptoren, afscheiden van IL-21 en IL-4 en Toon van nucleaire uitdrukking van de transcriptiefactor, BCL-62,3. Zoals hun naam al suggereert, ze zijn te vinden in germinal centra en essentieel zijn voor de hoge affiniteit antilichaam productie1.
Dysregulated Tfh reacties zijn betrokken bij de pathogenese van de ziekte, vooral auto-immuunziekte, waar zij het promoten van de uitbreiding van autoreactieve B cellen4. Ze spelen ook een rol in de communicatie van de tumor van zowel solide5,6 en lymfoïde kankers7. Omgekeerd, genetische afwijkingen van oppervlakte eiwitten essentieel voor Tfh functioneren zoals afleidbare T-cel costimulator (ICOS) resultaat in menselijke immunodeficiency syndromen8. CD4+ CXCR5+ cellen in het perifere bloed circuleren folliculaire T helper cellen (cTfh) worden genoemd en worden verondersteld te worden van het geheugencompartiment van Tfh cellen in weefsels9. Het doel van de hier beschreven methode is de analyse van cTfh deelverzamelingen na CD4+ cel los van perifeer bloedmonsters.
Verschillende cTfh deelverzamelingen zijn gedefinieerd en de efficiëntie waarmee zij B-cel helpen verschilt van een subset aan nog een9,10,11,12. Het relatieve aandeel van deze deelverzamelingen worden gewijzigd in een aantal ziekten, meest prominent auto-immune ziekte waarbij er bijna altijd een relatieve stijging van de functioneler PD-1 is+/ hi en/of cTfh2 of cTfh17 deelverzamelingen in vergelijking met de minder functionele PD-1– en/of cTfh1 deelverzamelingen12. De omvang van deze veranderingen vaak associëren met klinische parameters, met inbegrip van ziekte activiteit en autoantibody titers, die een mogelijke rol van cTfh deelverzameling distributie als een voorspellende biomarker in ziekte, die kan duiden op de activiteit van Tfh in lymfoïde weefsels9,12,13,14. Daarnaast nemen van bloedmonsters van de deelnemers is snel, veilig en aanvaardbaar, en zulks toestaat seriële monitoring voor de analyse van de voortgang van de ziekte of de respons op therapie.
Het gebruik van geïsoleerde CD4+ T-cellen over traditionele perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNC) schorsingen kunnen hogere doorvoer stroom cytometry experimenten door het verminderen van de benodigde tijd voor het verwerven van een aanzienlijk aantal cTfh cellen voor analyse. Dit is vooral handig wanneer cell sorting (FACS) sorteren van cellen uit deelverzamelingen van de zeldzame cTfh met behulp van stroom geactiveerd. Om te helpen de efficiëntie, kunnen deze schorsingen worden cryopreserved om te schakelen “batching” van monsters worden gebruikt in de stroom cytometry experiment. Op het testen, de CD4+ zuiverheid was niet verminderd door cryopreservatie.
Terwijl verschillende laboratoria gebruikt verschillende markeringen te categoriseren van cTfh cellen in de vroege stadia van hun ontdekking, de methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een uniforme regeling van twee groepen celoppervlak markeringen zoals voorgesteld door Schmidt et al.12, 15 om de gelijktijdige vaststelling van cTfh en hun negen erkende deelverzamelingen in een enkele stroom cytometry experimenteren.
Als enige cel oppervlakte markeringen worden gebruikt, worden de cellen vereisen geen fixatie of permeabilization, en dus kunnen blijven leven voor downstream functionele studies. Dit vergemakkelijkt kan worden door de cel sorteren via FACS met hetzelfde antilichaam panel. Dit paneel kan worden uitgebreid tot andere markeringen, rekening houdend met de beperkingen van de cytometer van de stroom wordt gebruikt.
De analyse van Multi-Color stroom cytometry experimenten kan worden uitdagend vanwege de inherent subjectieve aard van gating op 2-dimensionale dot plots, vooral wanneer cel populaties niet over een duidelijke bi-modale verdeling in marker fluorescentie, aangezien de Case voor cTfh cellen en hun subsets. Om deze reden is het noodzakelijk om in te stellen doeltreffende controles om de artefacten te stellen betere resolutie van populaties en gating strategieën vol vertrouwen. Als zodanig, antilichaam deelvenster Ontwerp en de opzet van elementaire controles voor een stroom cytometry experimenteren, dat wil zeggen, met behulp van compensatie en FMO besturingselementen worden uiteengezet in stap 3.4.2 en 3.4.3,respectively.
Alle cTfh cellen zijn gedefinieerd als CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Het niveau van meningsuiting van de karakteristieke Tfh activering markering PD-1 kan vervolgens worden bepaald om te identificeren van de deelverzamelingen van PD-1–, PD-1+ of PD-1hi cTfh cellen. Vervolgens met behulp van een combinatie van de chemokine receptoren, CXCR3 en CCR6, die zijn differentieel uitgedrukt door traditionele Th1 2 of 17 cellen, cTfh kan gekarakteriseerd worden als cTfh1, 2- of 17-achtige door een profiel van de CXCR3+ CCR6–, CXCR3– CCR6– , en CXCR3– CCR6+, respectievelijk.
De antilichaam-deelvenster gebruikt door ons laboratorium is weergegeven in tabel 1. De gebruiker kan moeten aanpassen van de selectie van hun fluorophore ter verantwoording voor de laser en licht filter configuratie beschikbaar op hun lokale stroom cytometer.
De volgende overwegingen van invloed op de keuze van fluorophores. Gebruik heldere fluorophores waar mogelijk. In het bijzonder de helderste beschikbaar fluorophores op het schemerigste (minder sterk uitgedrukt) markeringen gebruiken. Dimmer markeringen bevatten PD-1, CXCR3 en CCR6, en in mindere mate, CXCR5. Wij specifiek gebruik gemaakt van de nieuwere BB, BV en BUV fluorophores die bieden uitstekende helderheid en dus in staat stellen gemakkelijker resolutie van verschillende populaties van de cellen.
De selectie van fluorophore verspreid over de emissie spectra zo veel mogelijk te minimaliseren spectrale overlap en dus het niveau van compensatie vereist. Een gratis, online tool die gebruikt kan worden om te helpen met het ontwerpen van een stroom cytometry paneel kan hier worden gevonden: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Om ruimte te besparen op het emissiespectrum, we gebruikt een “dump kanaal” met behulp van een levensvatbaarheid kleurstof met een golflengte van emissie die met dat van APC-H7 (geconjugeerd met CD45RA overlapt) zodat de detectie (en uitsluiting) van beide doden en/of CD45RA+ met behulp van een één detector.
Hier is een protocol voor de isolatie van perifeer bloed CD4+ T-cellen en hun latere analyse gepresenteerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van de verschillende en recent beschreven circulerende deelverzamelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol vormt een eenvoudige en efficiënte manier om het analyseren van de cellen van de cTfh van het perifere bloed, waardoor de detectie van alle relevante deelverzamelingen geïdentificeerd in de literatuur tot nu toe. Eenvoudig en efficiënt kan bloedmonsters als onderdeel van de standaard poliklinieken en seriële monsters op parallel met klinische gegevens kan worden verzameld. Op zijn beurt, hierdoor prospectieve studies cTfh deelverzamelingen evaluatie als biomarkers voor ziekte progressie of reactie op beh…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door een subsidie van leukemie UK ETB en MJA.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
Referenzen
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
