Изоляция CD4+ Т-клеток и анализ циркулирующих Т-фолликулярная помощник (cTfh) клеток подмножеств из периферической крови с помощью 6-цвет потока цитометрии

Summary

Здесь, протокол для изоляции и характеристика CD4⁺ Т-клеток описал подмножеств из периферической крови человека. Очищенный CD4⁺ Т-клетки анализируются проточной цитометрии для определения пропорции T-фолликулярных клеток помощник подмножеств.

Abstract

Ненормальная T-фолликулярная активность клеток помощник (ЦГЗ) обнаружен в аутоиммунных условий, и их присутствие ассоциируется с клинических исходов при анализе микроокружения лимфоузлов в B-клеточной неходжкинской лимфомы. Подмножества циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh), циркулирующей отсека памяти Tfh клеток в крови, также возмущенных в болезни и поэтому представляют собой потенциальный Роман интеллектуального биомаркеров. Периферической крови ориентированное тестирование выгодно, потому что это относительно неинвазивные и позволяет простой последовательный мониторинг. Эта статья описывает метод для изоляции CD4⁺ Т-клетки из крови человека и дальнейшего анализа подачей cytometry перечислить cTfh клеток и пропорции их различных подмножеств (cTfhPD-1^{-/ +/ Привет}, cTfh1, 2, 17 и cTfh1/17). Уровень этих подмножеств был затем сравнить между обычные предметы и пациентов с лимфомой. Мы обнаружили, что метод был достаточно прочным, чтобы получить надежные результаты регулярно собранного материала пациента. Техника, которую мы опишем для анализа может быть легко адаптирована для сортировки клеток и нисходящие приложения, такие как RT-PCR.

Introduction

T-фолликулярная хелперы (ЦГЗ) являются CD4 Т-клеток подмножества, который первоначально был охарактеризован в лимфоидной ткани¹⁺ . Эти клетки выразить PD-1 и CXCR5 поверхностная рецепторов, секретируют Ил-21 и Ил-4 и показать выражение ядерного транскрипционного фактора, BCL-6^2,3. Как их названия, они находятся в зародышевых центров и необходимы для высокое сродство антитела производства¹.

Dysregulated Tfh ответы были вовлечены в патогенез заболевания, прежде всего аутоиммунных заболеваний, где они способствуют расширению клетки аутореактивная B⁴. Они также играют роль в микроокружения опухоли твердых^5,6 и⁷лимфоидной опухоли. И наоборот генетические дефекты поверхности белков, необходимых для Tfh функционировать как индуцибельной Т-клеточной costimulator (МСОН) результат в синдромы иммунодефицита человека⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ клеток в периферической крови человека называются циркулирующих Т-фолликулярных клеток помощник (cTfh) и считается отсек памяти Tfh клеток в тканях⁹. Цель метода, описанного здесь является анализ cTfh подмножеств после CD4⁺ ячейки изоляции от периферической крови.

Были определены несколько подмножеств cTfh и эффективность, с которой они помогают B-клетка отличается от одной подмножество другой^9,10,,1112. Относительные пропорции этих подмножеств изменяются в ряде заболеваний, наиболее заметно аутоиммунное заболевание в котором есть почти всегда является относительное увеличение более функциональных PD-1^{+/ Привет} или cTfh2 или cTfh17 подмножества по сравнению с менее функциональные PD-1^– или cTfh1 подмножеств¹². Масштабы этих изменений часто связать с клинические параметры, включая болезнь активности и аутоантител титры, указывающее потенциальную роль cTfh подмножество распределения как прогностического биомаркера в болезнь, которая может отражать деятельность ЦГЗ в лимфоидной ткани^9,12,,1314. Кроме того проб крови от участников является быстрым, безопасным и приемлемым и поэтому позволяет последовательный мониторинг для анализа прогрессирования заболевания или ответа на терапию.

Использование изолированных CD4⁺ Т-клетки над традиционными периферической крови одноядерных клеток (PBMNC) подвески позволяет выше пропускная способность потока цитометрии эксперименты путем сокращения времени, необходимого для приобрести значительное количество клеток cTfh для анализа. Это особенно полезно, когда сортировка клеток из редких cTfh подмножества потока с помощью активации клеток, сортируя (FACS). Чтобы помочь эффективности, эти подвески можно криоконсервированных для включения «Пакетная обработка» образцов для использования в эксперименте цитометрии потока. На тестирование, CD4⁺ чистоты не было уменьшено криоконсервирования.

Хотя здесь представлены различные лаборатории используются различные маркеры классифицировать cTfh клеток на ранних стадиях их открытия, метод делает использование единой схемы двух групп клетк поверхности маркеров, предложенный Шмидт et al.^{12, 15} для одновременной идентификации cTfh и их девяти признанных подмножества в одном проточной цитометрии эксперимент.

Как используются только маркеры поверхности клетки, клетки не требуют фиксации или permeabilization и таким образом могут оставаться живыми течению функциональных исследований. Это могло бы способствовать путем сортировки с помощью СУИМ с той же панелью антитела клетки. Эта группа может быть расширена для включения других маркеров, позволяя для ограничения потока цитометр используется.

Анализ потока многоцветные цитометрии экспериментов может быть сложным из-за по существу субъективный характер стробирования на 2-мерной точки участках, особенно когда клеточных популяций не имеют четкой Би Модал распределения в маркер флуоресценции, как это чехол для cTfh клеток и их подмножества. По этой причине важно создать эффективные механизмы контроля для уменьшения артефактов лучше разрешение населения и установить стробирования стратегии уверенно. Таким образом дизайн панели антитела и настройке основных элементов для проточной цитометрии эксперимента, то есть, используя компенсации и FMO контроля изложены в шаге 3.4.2 и 3.4.3,respectively.

Все cTfh клетки определяются как CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Уровень выражения характерным Tfh маркера активации PD-1 затем может быть определен для определения подмножества PD-1^–, PD-1⁺ или PD-1^Привет cTfh клетки. Затем, используя комбинацию хемокиновых рецепторов, CXCR3 и CCR6, которые дифференцировано выраженные традиционных Th1, 2 или 17 клетки, cTfh можно охарактеризовать как cTfh1, 2-17-как по профилю CXCR3⁺ CCR6^–, CXCR3^– CCR6^– и CXCR3^– CCR6⁺, соответственно.

В таблице 1отображается панель антитела, используемые в нашей лаборатории. Пользователю может потребоваться адаптировать их Флюорофор выбор для учета для лазерных и светофильтр конфигурации доступны на их местных проточный цитометр.

Следующие факторы влияют на выбор флуорофоров. Используйте яркие флуорофоров, там, где это возможно. В частности используйте ярких доступных флуорофоров на тёмной (менее сильно выраженной) маркеры. Диммер маркеры включают PD-1, CXCR3 и CCR6 и в меньшей степени, CXCR5. Мы специально сделали использование новых BB, БВ и був флуорофоров, которые обеспечивают отличную яркость и таким образом позволяют проще резолюции различных популяций клеток.

Распространение Флюорофор выбор через спектры выбросов, насколько это возможно свести к минимуму спектрального наложения и, таким образом, уровень компенсации требуется. Бесплатно, онлайн инструмент, который может использоваться для оказания помощи в проектировании группа цитометрии потока можно найти здесь: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Для экономии места на спектр излучения, мы заняты каналом «дампа» с помощью жизнеспособности краска с длина волны излучения, которая перекрывается с что APC-H7 (конъюгированных с CD45RA) для включения обнаружения (и исключения) оба умерли или CD45RA⁺ с помощью один детектор.

Здесь протокол для изоляции периферической крови CD4⁺ Т-клеток и их последующего анализа представлена проточной цитометрии для определения пропорции различных и недавно описал, циркулирующих подмножеств.

Protocol

Образцы крови были получены от обычных предметов (НС) (n = 12) а также пациентов с лимфомой маргинальные зоны (MZL) (n = 7) и других типов B-клеточной неходжкинской лимфомы (BNHL) (6 FL больных, 2 Лимфоплазмоцитарной лимфомы пациента и 1 низкосортных B-клетки Неходжкинской лимфомы не оговорено пациент?…

Representative Results

Высоким CD4+ чистоты была достигнута с помощью CD4+ Протокол изоляции, который был надежным во всех образцов крови проверена нами (означает: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (рис. 3). Выявление cTfh (CD4+ CXCR5+ клетки) в предста?…

Discussion

Этот протокол представляет собой простой и эффективный способ для анализа клеток периферической крови cTfh, Включение обнаружения всех соответствующих подмножеств, идентифицированных в литературе. Можно легко и эффективно получить образцы крови, как часть стандартных амбулаторных кл?…

Materials

RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973