생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법
Summary
단백질 합성은 세포에 대 한 중요 한 생물학적 과정. 뇌에서는 적응 적 변화에 필요합니다. 그대로 뇌에서 단백질 합성의 속도의 측정은 신중한 방법론고려가 필요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 대뇌 단백질 합성의 국소 비율의 측정을 위한 L-[1-14 C]-류신 정량적 자가 방사선 측정 방법을 제시한다.
Abstract
단백질 합성 개발 및 신경 기능의 유지 보수에 필요한 하 고 신 경계에 적응 변화에 관여. 더욱이, 신경계에서 단백질 합성의 dysregulation는 몇몇 발달 무질서에 있는 핵심 표현형일지도 모르다 생각됩니다. 동물 모델에서 대뇌 단백질 합성의 속도의 정확한 측정은 이러한 장애를 이해하는 데 중요합니다. 우리가 개발한 방법은 깨어 있는, 행동하는 동물의 연구 결과에 적용될 수 있도록 디자인되었습니다. 그것은 정량적 인 자가 방사선 사진 방법이므로 뇌의 모든 영역에서 동시에 속도를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 추적 아미노산, L-[1-14 C]-류신, 및 뇌에서 L-류신의 행동의 운동 모델의 사용에 기초한다. 우리는 L-[1-14 C]-leucine을 트레이서로 선택했는데, 이는 불필요한 라벨이 붙은 대사 산물로 이어지지 않기 때문입니다. 그것은 단백질로 통합되거나 급속하게 두뇌에 있는 표지되지 않은 CO2의 큰 풀에서 희석되는 14CO2를 산출하기 위하여 물질 대사로 변화됩니다. 상기 방법 및 모델은 또한 단백질 합성을 위한 조직 전구체 풀에 조직 단백질 분해로부터 유래된 표지되지 않은 류신의 기여를 허용한다. 이 방법은 세포와 신경 층뿐만 아니라 시상 하부 및 두개골 신경 핵에서 단백질 합성 속도를 결정하는 공간 해상도를 갖는다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량 적 데이터를 얻으려면 절차 세부 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 단백질 합성의 국소 비율의측정을 위한 정량적인 자기 방사선 측정 L-[1-14 C]-leucine 방법의 상세한 절차를 제시합니다.
Introduction
단백질 합성은 신경계에서 장기적인 적응 변화에 필요한 중요한생물학적 과정1. 단백질 합성을 억제하는 것은 무척추 동물과 척추 동물모두에서 장기 기억 저장을 차단2 . 단백질 합성은 장기 적인 potentiation의 어떤 양식의 후기 단계의 유지보수에 필수적이다 (LTP) 장기 우울증 (LTD)3,개발 중 신경 생존4,그리고 뉴런과 그 시냅스 연결5. 뇌 단백질 합성의 속도의 측정 적응 변화 뿐만 아니라 신경 발달 장애 및 학습 및 메모리와 관련 된 장애를 공부 하는 중요 한 도구가 될 수 있습니다.
우리는 생체 내 생체 내 또는 뇌 조직의 시험관 내 제제에서 속도를 추정하는 다른 기술에 비해 내재된 이점을 제공하는 깨어있는동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성의 비율을 정량화하는 방법을 개발했습니다 6. 가장 중요한 것은 깨어있는 동물의 손상되지 않은 뇌의 측정에 대한 적용성입니다. 이것은 시 냅 스 구조와 장소에 사후 mortem 효과 대 한 걱정 없이 측정을 허용 하기 때문에 주요 고려 사항. 또한, 우리가 사용하는 정량적 자기 방사선 접근 방식은 공간 국소화의 높은 수준을 달성한다. 14C의 에너지는 우리가 세포 이하 또는 세포 수준에서 추적자를 현지화할 수 없는 반면, 우리는 세포 층및 시상 하부 핵과 같은작은 두뇌 지구에서 비율을 측정할 수 있습니다, 대략 25 μm 해결책 7.
방사성 추적자를 사용하여 생체 내 측정의 한 가지 과제는 방사성 표지가 반응하지 않은 표지 전구체 또는 기타 외부 표지 된 대사산물 6이 아닌 관심있는 반응의 산물인지 확인하는 것입니다. 우리는 단백질에 통합되거나 14CO2로 빠르게 대사되기 때문에 추적아미노산으로 L-[1-14 C]-leucine을 선택했는데, 이는 높은 비율로 인한 뇌의 라벨이 없는 CO2의 큰 풀에서 희석됩니다. 에너지 대사8. 더욱이, 단백질에 통합되지 않은 임의의 14C는주로 자유 [14 C]-류신으로 존재하며, 이는 60분 동안 실험 기간 동안, 조직6으로부터거의 전적으로 제거된다. 단백질은 그 때 포르말린을 가진 조직에 고정되고 그 후에 자과 방사선 촬영 의 앞에 어떤 자유로운[14C]leucine를 제거하기 위하여 물로 헹구는.
또 다른 중요한 고려 사항은 조직 프로테오분해로부터 유래된 표지되지 않은 아미노산에 의한 전구체 아미노산 풀의 특이적 활성의 희석의 문제이다. 우리는 성인 쥐와 마우스에서, 두뇌에 있는 단백질 종합을 위한 전구체 류신 풀의 대략 40%가 단백질분해에서 파생된 아미노산에서 온다는 것을 보여주었습니다 6. 이것은 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 지역 비율의 계산에 포함되어야 하고 이 관계가 변경될 수 있는 연구 결과에서 확인되어야 합니다. 이론적 기초와 방법의 가정은 다른 곳에서 자세히 제시되었다6. 이 문서에서는 이 방법론의 적용 절차 적 문제에 중점을 둡니다.
이 방법은 지상 다람쥐9,양10,rhesus 원숭이11,쥐12,13,14,15,16에서 rCPS의 결정에 사용되었습니다. , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 도 21,뇌경화증 복합체(22)의 마우스 모델, 깨지기 쉬운 X 증후군23,24,25,26,깨지기 쉬운 X 전열 마우스(27) 및 페닐케톤뇨리아28의마우스 모델. 이 원고에서는 생체 내 자가 방사선 사진 L-[1-14 C]-류신방법을 사용하여 rCPS의 측정 절차를 제시합니다. 우리는 깨어 있는 대조군 마우스의 두뇌 지구에 있는 rCPS를 제시합니다. 우리는 또한 anisomycin의 생체 내 투여, 번역의 억제제, 뇌의 단백질 합성을 폐지 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 실험 동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 국소 비율의 측정을위한 정량적 방법을 제시한다. 이 방법은 기존 방법에 비해 상당한 장점이 있습니다 : 1. 측정은 깨어 있는 동물에서 이루어지므로 기능하는 뇌의 지속적인 프로세스를 반영합니다. 2. 측정은 동시에 뇌의 모든 영역과 하위 영역에서 rCPS를 결정할 수있는 능력을 제공하는 양적 자가 방사선 촬영에 의해 이루어집니다. 3. 이 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 생쥐의 게노티핑에 대한 젠젠시아, 아미노산 및 필름의 처리를 위한 톰 벌린, 그리고 일부 rCPS 실험을 수행하기 위한 메이진을 인정하고자 한다. 이 연구는 NIMH, ZIA MH00889의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. RMS는 또한 자폐증 말하기 박사 후 펠로우십 8679 및 FRAXA 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Referenzen
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