Количественный авторадиографический метод для определения региональных показателей синтеза церебрального белка в Vivo
Summary
Синтез белка является критическим биологическим процессом для клеток. В головном мозге он необходим для адаптивных изменений. Измерение темпов синтеза белка в нетронутом мозге требует тщательного методологического рассмотрения. Здесь мы представляем количественный авторадиографический метод L-1-14C-leucine для определения региональных показателей синтеза церебрального белка in vivo.
Abstract
Синтез белка необходим для развития и поддержания нейронной функции и участвует в адаптивных изменениях в нервной системе. Кроме того, считается, что дисрегуляция синтеза белка в нервной системе может быть основным фенотипом при некоторых нарушениях развития. Точное измерение темпов синтеза мозгового белка в животных моделях имеет важное значение для понимания этих расстройств. Разработанный мы метод был разработан для изучения бодрствования, ведут себя животные. Это количественный авторадиографический метод, поэтому он может давать ставки во всех регионах мозга одновременно. Метод основан на использовании аминокислоты трассировщика, L-1-14C-leucine, и кинетической модели поведения L-лейцина в головном мозге. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве трассировщика, потому что это не приводит к посторонним помеченным метаболическим продуктам. Он либо включен в белок, либо быстро метаболизируется, чтобы дать 14CO2, который разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в головном мозге. Метод и модель также позволяют вносить немаркированный лейцин, полученный из протеолиза тканей, в пул прекурсоров тканей для синтеза белка. Метод имеет пространственное разрешение для определения темпов синтеза белка в клеточных и нейропиловых слоях, а также гипоталамических и черепных нервных ядер. Для получения надежных и воспроизводимых количественных данных важно придерживаться процедурных деталей. Здесь мы представляем подробные процедуры количественного авторадиографического l-1-14C-leucine метод для определения региональных показателей синтеза белка in vivo.
Introduction
Синтез белка является важным биологическим процессом, необходимым длядолгосрочных адаптивных изменений в нервной системе 1. Ингибирование синтеза белка блокирует длительное хранение памятикак у беспозвоночных, так и у позвоночных 2. Синтез белка необходим для поддержания поздних фаз некоторых форм долгосрочного потенции (ЛТП) и длительной депрессии (LTD)3, выживаемости нейронов при разработке4,а также для общего поддержания нейрона и его синаптические соединения5. Измерение темпов синтеза белка мозга может быть важным инструментом для изучения адаптивных изменений, а также нейроразвития расстройств и расстройств, связанных с обучением и памятью.
Мы разработали метод количественной оценки темпов синтеза церебрального белка in vivo в бодрствующих животных, который предлагает присущие преимущества по сравнению с другими методами, которые оценивают скорость в ex vivo или in vitro препаратов ткани мозга6. В первую очередь применимость к измерениям в нетронутом мозге у бодрствуем животного. Это ключевое соображение, поскольку оно позволяет измерения с синаптической структуры и функции на месте и без опасений по поводу посмертного эффектов. Кроме того, количественный авторадиографический подход, который мы используем, достигает высокой степени пространственной локализации. В то время как энергия 14C такова, что мы не можем локализовать трассировщик на субклеточном или клеточном уровне, мы можем измерить скорость в слоях клеток и небольших областях мозга, таких как гипоталамические ядра, примерно с разрешением 25 мкм7.
Одна из задач in vivo измерений с радиотизмерителями заключается в том, чтобы гарантировать, что радиомаркировка измеряется в продукте реакции интереса, а не неотреагированы помечены предшественником или других посторонних помечены метаболических продуктов6. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве аминокислоты трассировщика, потому что она либо включена в белок, либо быстро метаболизируется до 14CO2, которая разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в мозге в результате высокой скорости энергетический метаболизм8. Кроме того, любой 14C не включены в белок существует в первую очередь как свободный –14C-leucine, который в течение 60 минут экспериментального периода, почти полностью очищены от ткани6. Белки затем фиксируются в ткани с формалином, а затем промыть водой, чтобы удалить любые свободные14C-leucine до авторрадиографии.
Другим важным соображением является вопрос о разбавлении специфической активности аминокислотного пула прекурсоров немаркированными аминокислотами, полученными из протеолиза тканей. Мы показали, что у взрослых крыс и мышей, около 40% из резерва лейцина бассейн для синтеза белка в мозге происходит от аминокислот, полученных из белка распада6. Это должно быть включено в расчет региональных показателей синтеза церебрального белка (rCPS) и должно быть подтверждено в исследованиях, в которых эта взаимосвязь может измениться. Теоретическая основа и предположения метода были подробно представлены в другом месте6. В настоящем документе мы сосредоточиваемся на процедурных вопросах применения этой методологии.
Этот метод был использован для определения rCPSу сусликов 9, овец10, ресус обезьян11, крыс12,13,14,15,16 , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21, мышь модель туберозного склероза комплекса22, мышь модель хрупкого синдрома X23,24,25,26, хрупкие X перестановки мышей27, и мышиная модель фенилкетонурии28. В этой рукописи мы представляем процедуры измерения rCPS с помощью метода in vivo авторадиографического L-1-14C-leucine. Мы представляем rCPS в областях мозга пряткать мышь управления. Мы также демонстрируем, что in vivo введение анисомицина, ингибитора перевода, отменяет синтез белка в головном мозге.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем количественный метод определения региональных показателей синтеза церебральных белков (rCPS) in vivo у экспериментальных животных. Этот метод имеет значительные преимущества перед существующими методами: 1. Измерения производятся в бодрствующее поведение животного, поэто…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить, Зенгян Ся для генотипирования мышей, Том Burlin для обработки аминокислот и фильмов, и Мэй Цинь для выполнения некоторых из экспериментов rCPS. Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIMH, ЗИА MH00889. RMS также поддерживается аутизмом говорит постдокторской стипендий 8679 и FRAXA постдокторской стипендий.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Referenzen
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
