Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.
Het hoornvlies is gebruikt uitgebreid als een modelsysteem om te studeren wondgenezing. De mogelijkheid om te produceren en gebruiken van primaire cellen van zoogdieren in twee dimensionale (2D) en drie dimensionale (3D) cultuur heeft geleid tot een schat aan informatie niet alleen over hoornvlies biologie, maar ook over de wond genezing, myofibroblast biologie, en littekens in het algemeen . Het doel van het protocol is een assay-systeem voor het kwantificeren van de ontwikkeling van de myofibroblast, die kenmerkend is voor littekens. We tonen een hoornvlies orgel cultuur ex vivo model met behulp van varken ogen. In deze voorste keratectomy wond, zijn cornea’s nog steeds in de hele wereld gewond met een cirkelvormige mes genaamd een trephine. Een stekker van ongeveer 1/3 van het anterieure hoornvlies wordt verwijderd met inbegrip van het epitheel, de kelder-membraan en het voorste deel van het stroma. Na verwonding, hoornvlies gesneden uit de hele wereld, gemonteerd op basis van de collageen/agar en gekweekte voor twee weken in de gratis medium aangevuld-serum met gestabiliseerde vitamine C uitbreiden van celproliferatie en afscheiding van de extracellulaire matrix door fibroblasten resident. Activering van myofibroblasts in het anterieure stroma is duidelijk in het hoornvlies genezen. Dit model kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van wond sluiting, de ontwikkeling van myofibroblasts en fibrotische markeringen, en toxicologische studies. Daarnaast kunnen de effecten van klein molecuul remmers evenals lipide-gemedieerde siRNA transfectie voor gene knockdown worden getest in dit systeem.
Littekens in het hoornvlies als gevolg van letsel, trauma of infectie kan leiden tot slopende opaciteit en permanente visie verlies. Er is dus dringend behoefte om te identificeren van de trajecten die voor therapeutische interventie kunnen worden gericht. Huidige behandelingsopties zijn beperkt en bestaat voornamelijk uit het hoornvlies transplantaties, die niet toegankelijk voor patiënten over de hele wereld zijn. Zowel de mens (Figuur 1) en de dierlijke hoornvlies kunnen worden gebruikt voor 2D en 3D-celkweek studies1,2. Menselijke cadaver hoornvlies niet geschikt is voor transplantatie kunnen worden verkregen van eye banken of gecentraliseerd weefselbanken (nationale ziekte onderzoek Interchange (NDRI)), en dierlijke ogen kunnen worden verkregen in een abattoir. Primaire hoornvlies epitheliale cellen, stromale fibroblasten en meer recentelijk, endotheliale cellen, kunnen worden geïsoleerd en gekweekt uit deze weefsels voor wondgenezing en toxicologische studies3,4,5. Naast het belang van inzicht in de moleculaire basis van verblindende oogziekte, heeft de toegankelijkheid van weefsel en de mogelijkheid om cultuur primaire cellen gemaakt het hoornvlies een belangrijk model-systeem voor studie. Het hoornvlies is ideaal voor het testen van de effecten van agenten op littekens als het normale hoornvlies transparant is en bepaalde soorten wonden maken opaciteit of fibrotische littekens (herzien in6). Verschillende in vivo hoornvlies wond genezing modellen hebben ook uitgebreid gebruikt voor studies1littekens. Minder gebruikt is geweest de ex vivo hoornvlies wond genezing model7,8 die in detail hier is beschrijven. Het doel van deze methode is te kwantificeren littekens resultaten gekenmerkt door fibrotische beleidsmakers in een 3D meercellige hoornvlies ex vivo modelsysteem.
Hoornvlies epitheliale verwonding die geen inbreuk op de epitheliale kelder membraan normaal vormt sluit binnen 24-72 h9. Kort na de verwonding beginnen de cellen aan de rand van het epithelium verspreiden en migreren naar de epitheliale vrije oppervlakte, te herstellen van epitheliale barrièrefunctie. Deze activiteit wordt opeenvolgend gevolgd door activering van hoornvlies basale celproliferatie, ten eerste en in een later stadium, van voorlopercellen attractiepark van de buitenste limbal zone tot herstel van de epitheliale cellen massa10,11. Deze wonden genezen vaak zonder littekens. Een wond die het membraan van de kelder in het stroma vaak doordringt resulteert echter in litteken vorming1. Na het hoornvlies stromale verwonden, is het stroma gevuld met cellen van verschillende oorsprong, met inbegrip van gedifferentieerde resident stromale cellen, alsmede het beenmerg-afgeleide fibrocytes12,13,14. Fibrotische littekens wordt gekenmerkt door de persistentie van myofibroblasts in een genezende wond. Deze pathologische myofibroblasts tonen verhoogde hechting door de accumulatie van verschijnsel in focal verklevingen, contractiele α-smooth actine (α-SMA) stress spiervezels en lokaal activeren van extracellulaire matrix (ECM)-afgezonderd latente-transformeren groeifactor-beta (TGFβ). De differentiatie van epitheliale-afgeleide cellen, bekend als epitheliale mesenchymale overgang (EMT), kan ook bijdragen tot litteken vorming6.
Er is een delicaat evenwicht tussen celdifferentiatie en apoptosis na verwonding. Wegens de breuk in het membraan van de kelder, groeifactoren zoals bloedplaatjes afkomstige groei factor (PDGF) en TGFβ van tranen en het epithelium baden de stroma, inducerende myofibroblast differentiatie, een lus van de duurzame autocrine van TGFβ de activering, en de secretie van ongeorganiseerd fibrotische ECM15,16. De persistentie van de myofibroblasts in de genezen wond bevordert haze en littekens in het hoornvlies (Figuur 2). Echter, in regeneratively genezen wond hoewel myofibroblasts ontwikkelen, ze neutrophil en aldus zijn afwezig of aanzienlijk verminderd in aantal in het genezen weefsel (herzien in verwijzing6,10). Zo heeft onderzoek focuste fibrotische littekens op zijn minst gedeeltelijk zich op gericht op moleculen die voorkomen buitensporige myofibroblast ontwikkeling of myofibroblast persistentie17,18 dat. Omdat myofibroblast persistentie zowel littekens en fibrotische ziekte in alle weefsels19 kenmerkt, kan het hoornvlies zinvol zijn als een modelsysteem om te studeren van algemene cellulaire mechanismen van fibrose.
In ons modelsysteem, wordt het hoornvlies verwond met een cilindrische mes genaamd een trephine terwijl nog steeds in de hele wereld. Mens en varken hoornvlies kunnen worden verwond met beide een 6 of 7 mm trephine; voor konijn hoornvlies heeft een 6 mm trephine de voorkeur. Het varken hoornvlies is gelijkaardig in grootte aan het menselijke hoornvlies. Omdat ze kosteneffectief en beschikbaar in grote aantallen zijn, worden varken hoornvlies routinematig gebruikt voor orgel cultuur. Bovendien hebben antilichamen en siRNAs gemaakt om te reageren met mens consequent cross-reacted met varken7. Na de verwonding, hoornvlies worden gesneden uit de hele wereld met de limbus intact en gemonteerd op een agar/collageen basis. Het hoornvlies zijn gekweekt in serumvrij media plus gestabiliseerde vitamine C ter simulering van de fibroblast proliferatie en ECM afzetting20. De toevoeging van serum noch groeifactoren zijn nodig voor het opwekken van de myofibroblast formatie7. Hoornvlies worden routinematig vast en verwerkt voor histologie na twee weken van cultuur. Voor gen knockdown of voor het testen van de effecten van een agent op de wondgenezing, de wond kan worden behandeld met siRNA in de wond na verwonding7 of een oplosbare agent kan worden toegevoegd aan de media, respectievelijk8.
Dit protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de wondgenezing in een natuurlijke gestratificeerd 3D-omgeving. Gebruik van orgel cultuur als een intermediair tussen de celcultuur en in vivo onderzoek reduceert kosten alsmede vermindering procedures op levende dieren. Andere 3D-modellen hebben van groot nut zijn voor het veld inclusief zelf de synthese van collageen gels gemaakt van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten2 of deze dezelfde cellen ingebed in gels gemaakt van dierlijke…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NIH-NEI R01 EY024942, onderzoek te voorkomen blindheid, Upstate medische universiteit onbeperkte middelen voor onderzoek, en Lions District 20-Y. microscopie en beeldanalyse van paraffine secties werden uitgevoerd in de kern van de microscopie en histologische prepareren van objectglaasjes werd uitgevoerd in het Biorepository en de pathologie kern aan de School of Medicine van Icahn op de berg Sinaï.
PBS | Gibco | 10-010-023 | |
Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
Small scissor | Fisher | 895110 | |
Forceps | Fisher | 08953-F | |
Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
Lipofectamine 2000 | |||
Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |