Протокол для ex vivo роговицы орган культуры модель полезна для заживления ран исследований описано. Эта модель система может использоваться для оценки воздействия агентов для ускорения регенеративных заживления или токсичности препарата в организованной среде 3D многоклеточных.
Роговицы широко используется как модель системы для изучения заживление ран. Способность создавать и использовать основной mammalian клеток в двух размеров (2D) и три трехмерные (3D) культуры вызвало большой объем информации не только о роговицы биологии, но и о рану исцеление, Миофибробласт биологии и в целом рубцов . Целью протокола является системой пробирного для количественной оценки развития Миофибробласт, который характеризует рубцов. Мы демонстрируем роговицы орган культуры ex vivo модель с помощью свинья глаза. В этом передней кератэктомия раны с дисковой пилы, называемый трепаном являются ранения роговицы до сих пор в мире. Вилка примерно 1/3 передней роговицы удаляется, включая эпителия, базальной мембраны и передней частью стромы. После ранения, роговицу вырезанные из шара, смонтирован на базе коллагена/агар и культивируемых на две недели в дополнение сыворотка бесплатно средний с стабилизированный витамин C дополнить пролиферации клеток и внеклеточного матрикса секреции от резидентов фибробластов. Активация миофибробласты в передней стромы проявляется в исцелил роговицы. Эта модель может использоваться для анализа закрытия РАН, развитие миофибробласты и фиброзных маркеры и токсикологических исследований. Кроме того последствия малых молекул ингибиторов, а также липидов опосредованной siRNA трансфекции за нокдаун гена может испытываться в этой системе.
Рубцов в результате травмы, травмы или инфекции роговицы может привести к изнурительной помутнения и потере постоянного зрения. Таким образом есть острую необходимость определения путей, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства. Текущие параметры лечения ограничены и состоят в основном из операций по пересадке роговицы, которые не являются доступными для пациентов по всему миру. Человека (рис. 1) и животных роговицы может быть использован для 2D и 3D клеточной культуры исследования1,2. Не подходит для пересадки роговицы человека труп можно получить от глаз банков или централизованной тканевых банков (национальных болезни исследования обмена (НДРИ)), и животное глаза могут быть получены из скотобойни. Первичный роговицы эпителиальных клеток, фибробласты стромы и совсем недавно, эндотелиальные клетки, можно изолированные культивированный из этих тканей для заживления ран и токсикология изучает3,4,5. Помимо важности понимания молекулярные основы слепоте глазных болезней доступность ткани и способность к первичной культуре клеток сделал роговицы систему важной моделью для изучения. Роговицы идеально подходит для тестирования влияния агентов на рубцы, как нормальные роговицы является прозрачным и некоторых видов РАН создавать помутнения или фиброзных рубцов (обзор в6). Несколько в vivo роговицы рану исцеления модели широко использовались также для рубцов исследований1. Меньше использовать был ex vivo роговицы раны исцеления модель7,8 , опишите подробно здесь. Цель этого метода заключается в количественном определении рубцов результаты характеризуются фиброзных создателей в 3D многоклеточных роговицы ex vivo модели системы.
Роговицы эпителиальных ранения, которые не нарушают эпителиальных базальной мембраны обычно закрывается в течение 24-72 ч9. Вскоре после ранения, клетки на краю эпителия начать распространение и мигрируют в свободной поверхности эпителия, чтобы восстановить эпителиальные барьерную функцию. Эта деятельность последовательно следуют активации роговицы базально-клеточной пролиферации, первый и, в более поздней стадии, расположенные в зоне внешней послабляющие добиться восстановления эпителиальных клеток массы10,11клеток-предшественников. Часто эти раны заживают без рубцов. Однако рана, которая проникает стромы базальной мембраны часто приводит к шрам формирования1. После ранения роговицы стромы, строма заполняется с ячейками нескольких происхождения, включая дифференцированных резидентов стромальных клеток, а также костный мозг производные фиброциты12,,1314. Фиброзных рубцов характеризуется сохранением миофибробласты в заживления раны. Эти патологические миофибробласты продемонстрировать увеличение адгезии через накопление интегринов в фокуса спайки, сократительная α-гладких мышц актина (α-SMA) стресс волокон и локальная активация внеклеточного матрикса (ECM)-поглощенных латентный преобразование фактор роста бета (TGFβ). Дифференцировки эпителия производные клеток, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT), может также способствовать шрам формирования6.
Существует тонкий баланс между дифференцировки клеток и апоптоз после ранения. Из-за нарушения в базальной мембраны, факторы роста, такие, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и TGFβ от слез и эпителия купаться стромы, вызывая Миофибробласт дифференциации, устойчивый Аутокринный петля TGFβ активации и секрецию дезорганизованы фиброзных ECM15,16. Сохранением миофибробласты в зарубцевавшиеся раны способствует дымки и рубцов в роговице (рис. 2). Однако, в регенеративным зарубцевавшиеся раны хотя миофибробласты развиваются, они apoptose и таким образом отсутствуют или значительно сокращена в номер в зарубцевавшиеся ткани (обзор в ссылка6,10). Таким образом по крайней мере в части исследования по фиброзных рубцов уделялось ориентации молекул, которые препятствуют чрезмерной Миофибробласт развития или Миофибробласт сохранение17,18. Потому что Миофибробласт сохранение характеризует рубцов и фиброзных болезни всех тканей19, роговицы может быть полезным в качестве модельной системы для изучения общих клеточных механизмов фиброза.
В нашей модели системы с лезвием цилиндрические, называемый трепаном еще в мире ранения роговицы. Человека и свинья роговицы может быть ранен с либо 6 или 7 мм трепанации; для кролика роговицы трепаном 6 мм является предпочтительным. Свинья роговицы аналогичные по размеру человека роговицы. Потому что они являются экономически эффективным и легко доступны в больших количествах, свинья роговицы обычно используются для органной культуры. Кроме того антитела и малые интерферирующие РНК, сделал реагировать с человека последовательно cross-reacted с свинья7. После ранения, роговицы, вырезанные из шара с лимба нетронутыми и смонтирован на базы агар/коллагена. Роговицы культивировали в сыворотке свободных СМИ плюс стабилизированный витамин С для моделирования распространения фибробластов и ECM осаждения20. Добавлением сыворотки ни факторы роста необходимо побудить Миофибробласт формирования7. Роговицы обычно закрепляются и обрабатываются для гистологии после двух недель культуры. Нокдаун гена, или для проверки воздействия агента на заживление ран рану можно лечить с помощью малых интерферирующих РНК в рану после ранения7 или растворимые агента могут быть добавлены к средствам массовой информации, соответственно8.
Этот протокол описывает модель для изучения заживления ран в природных слоистых 3D-среде. Использование органной культуры в качестве посредника между клеточной культуры и в естественных условиях исследования значительно снижает затраты, а также сокращения процедуры на живых животных…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH-неи R01 EY024942, исследования, чтобы предотвратить слепоту, Upstate медицинского университета неограниченный исследовательских фондов, и львы район 20-ю. микроскопия и анализ изображений парафиновых срезах были исполнены на ЯДРЕ микроскопии и Гистологические слайд подготовка была исполнена на Biorepository и основной патологии в школе медицины Icahn на горе Синай.
PBS | Gibco | 10-010-023 | |
Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
Small scissor | Fisher | 895110 | |
Forceps | Fisher | 08953-F | |
Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
Lipofectamine 2000 | |||
Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |