Этот протокол описывает анализ флуоресцентно помеченных внутриклеточных отсеков в подающих надежды дрожжей с помощью многоцветной 4D (промежуток времени 3D) конфокальной микроскопии. Параметры изображения выбираются для захвата адекватных сигналов, ограничивая при этом фотоповреждения. Пользовательские плагины ImageJ позволяют отслеживать и количественно анализировать помеченные структуры.
Цель юристого протокола – охарактеризовать, как формируются и трансформируются в живые клетки подающих надежды дрожжей. Многие внутриклеточные отсеки в дрожжах динамичны, и полное понимание их свойств требует замедленной визуализации. Многоцветная 4D конфокальная флуоресценционная микроскопия является мощным методом отслеживания поведения и состава внутриклеточного отсека в временной шкале 5-15 мин. Строгий анализ динамики отсека требует захвата тысяч оптических Разделы. Для достижения этой цели фотоотбеление и фототоксичность сводятся к минимуму путем быстрого сканирования при очень низкой мощности лазера, а размеры пикселей и интервалы в шагах устанавливаются на самые большие значения, совместимые с выборкой изображения при полном разрешении. Полученные 4D наборы данных шумные, но могут быть сглажены путем деконволюции. Даже при высоком качестве данных, этап анализа является сложной задачей, поскольку внутриклеточные структуры часто многочисленны, неоднородны и мобильны. Для удовлетворения этой потребности, пользовательские плагины ImageJ были написаны для массива 4D данных на экране компьютера, определить структуры, представляющие интерес, отсеивать данные, чтобы изолировать отдельные структуры, количественно флуоресценции время курсы, и делать фильмы из прогнозируемых стеков. 4D-фильмы особенно полезны для различения стабильных отсеков от переходных отсеков, которые переворачиваются при созревании. Такие фильмы также могут быть использованы для характеристики таких событий, как слияние отсеков, и для проверки влияния конкретных мутаций или других возмущений.
Сравнения эндомембранной системы находятся в постоянном движении, и их полная характеристика требует визуализации живых клеток. Описано здесь протокол, который использует 4D (замедленное 3D) конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентно помечены отсеков в подающих надежды дрожжей. Метод был разработан для отслеживания динамики секретных отсеков в Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Этот протокол фокусируется на S. cerevisiae, который имеет нестоечный Golgi, вкотором отдельные цистерны оптически разрешимы4 . Необычная организация Golgi в S. cerevisiae позволила демонстрацию 4D микроскопией что цистерна Golgi первоначально маркирует с протеинами резидента предыдущих протеинов Golgi, и после этого теряет те протеины пока приобретающ резидента последние протеины Golgi3 ,5. Этот переход можно визуализировать, создавая штамм, в котором ранний белок Golgi Vrg4 помечен GFP, в то время как поздний белок Golgi Sec7 помечен мономерным красным флуоресцентным белком. Когда отдельные цистерны отслеживаются, созревание наблюдается как зелено-красное преобразование3. Этот тип анализа может предоставить ценную информацию о локализации белка и идентичности отсека. Например, два белка с слегка смещенным временем прибытия и отъезда иногда могут показаться, что они маркируют разные отсеки в статических изображениях, но их можно увидеть в 4D-фильмах, чтобы обозначить один и тот же отсек в разных временных точках6,7 . Таким образом, 4D микроскопия выявляет явления, которые в противном случае не были бы очевидны.
Информационная 4D микроскопия дрожжевых отсеков может быть достигнута с помощью соответствующих процедур и оборудования2. Когда это возможно, флуоресцентные пометки белка выполняется замена гена8, чтобы избежать переэкспрессии артефактов. Поскольку внутриклеточные структуры часто очень динамичны, 4D-изображение необходимо для обеспечения надежной обработки структуры с течением времени. В описанном здесь протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный детекторами высокой чувствительности. С помощью этого устройства, весь объем клеток S. cerevisiae может быть изображен конфокальной микроскопии примерно каждые 1-3 с, с 2 с интервалами является типичным. Данные могут быть собраны на срок до 5-15 мин в зависимости от плотности маркировки фторофоров и их фотофизических свойств. Основным препятствием является минимизация фотоотбелевания. Для этого интенсивность лазера сохраняется как можно ниже, скорость конфокального сканирования максимизируется, а оптические параметры настроены на изображение на пределе Nyquist, чтобы захватить соответствующую информацию, избегая при этом чрезмерного воздействия света. Эти настройки, как ожидается, также облегчить фототоксичность, фактор, который часто упускается из виду во время изображения живых клеток9,10,11. Полученные шумные данные обрабатываются с помощью алгоритмов коррекции отбеливателя и деконволюции для облегчения количественной оценки интенсивности флуоресценции.
Даже с высоким качеством 4D фильмов, анализ сложно, потому что дрожжевые отсеки, как правило, многочисленные, неоднородные, и мобильные. Из-за внутренних ограничений конфокальной микроскопии и неоптимальных настроек, необходимых для длительной 4D-визуализации, флуоресцентные структуры, которые находятся рядом друг с другом, трудно решить. Эту проблему можно обойти, сосредоточив внимание на небольшом количестве флуоресцентных структур, которые остаются оптически разрешимыми в течение периода маркировки, с предположением, что эти структуры являются репрезентативными для всей популяции маркированных Отделения. Флуоресцентные отсеки, которые можно надежно отслеживать, идентифицируются путем просмотра фильмов о проецируемом стеках и создания серии монтажей, в которых оптические секции для каждой временной точки выстраиваются на экране компьютера. В этом анализе используются пользовательские плагины ImageJ12, которые позволяют отслеживать индивидуальную структуру в изоляции.
Последние методы работы охватывает использование флуоресцентных белков в дрожжах13, а также теории и практики 4D конфокальной визуализации дрожжевых клеток2. Этот протокол фокусируется на ключевых практических аспектах эксперимента по визуализации 4D. Она включает в себя некоторые усовершенствования ранее описанных процедур, а также обновленные версии плагина ImageJ и документации. Показанный пример фокусируется на динамике Golgi, но этот протокол в равной степени подходит для визуализации других дрожжевых отсеков.
4D конфокальная визуализация дрожжевых органелл требует тщательной настройки нескольких параметров. Основной проблемой является фотоотбеление и фототоксичность. Типичный 4D фильм включает в себя сбор тысяч оптических секций, так что лазерное освещение должно быть как можно ниже. Танд?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM104010. Спасибо за помощь с флуоресценцией микроскопии Витас Bindokas и Кристин Лабно на комплексной микроскопии Основной фонд, который поддерживается NIH финансируемых онкологический центр Поддержка Грант P30 CA014599.
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |