Maya 4D mikroskopisi
Summary
Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.
Abstract
Bu protokolün amacı, membran bölmeler nasıl şekillendirmek ve tomurcuklanan Maya canlı hücrelerde dönüşümü karakterize etmektir. Maya ‘daki birçok hücre içi bölme dinamiktir ve özelliklerinin tam olarak anlaşılması zaman aşımı görüntüleme gerektirir. Çok renkli 4D konfoksel floresan mikroskopisi, 5-15 min. bir zaman ölçeğinde bir hücre içi bölme davranışını ve bileşimi izlemek için güçlü bir yöntemdir. bölme dinamiklerinin titiz analizi, binlerce optik Bölüm. Bu amaca ulaşmak için, fotobleaching ve fototoksisite çok düşük lazer gücüyle hızla tarama yaparak minimize edilir ve piksel boyutları ve Z-Step aralıkları, görüntüyü tam çözünürlükte örnekleme ile uyumlu olan en büyük değerlere ayarlanır. Ortaya çıkan 4D veri setleri gürültülü ancak deconvolution tarafından düzeltilebilir. Yüksek kaliteli verilerle bile, hücre içi yapıları genellikle çok sayıda, heterojen ve mobil olduğundan analiz aşaması zordur. Bu ihtiyacı karşılamak için, özel ımagej eklentileri bir bilgisayar ekranında dizi 4D veri yazılmıştır, ilgi yapıları belirlemek, bireysel yapıları izole etmek için verileri düzenlemek, floresan zaman kursları ölçmek, ve yansıtılan Z-yığınları film yapmak. 4D filmler özellikle olgunlaşma tarafından teslim geçici bölmeler kararlı bölmeleri ayırt etmek için yararlıdır. Bu tür filmler de bölme Fusion gibi olayları karakterize etmek ve belirli mutasyonlar veya diğer perturbations etkilerini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Endomembran sisteminin bölmeleri sürekli Flux ve tam karakterizasyonu canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada açıklanan 4D (zaman atlamalı 3D) konfetit mikroskopu kullanan bir protokoldür Mayalar tomurcuklanmış floresan etiketli bölmeleri görselleştirmek için. Yöntem Pichia pastoris ve Saccharomyces cerevisiae1,2,3‘ te salgı bölmeler dinamiklerini izlemek için geliştirilmiştir. Bu protokol, bireysel sarnılının optik olarak çözülebilir olduğu yığılmış olmayan bir Golgi olan S. cerevisiae ‘ye odaklanır4. S. cerevisiae ‘de olağandışı Golgi organizasyonu, bir Golgi sarnıçında başlangıçta ikamet eden erken Golgi proteinleriyle etiketleyerek 4d mikroskobu ile gösterimi etkinleştirmiş ve daha sonra Resident Late Golgi proteinlerini alırken bu proteinlerin kaybettiği3 ,5. Bu geçiş, geç Golgi proteini Sec7 monomerik kırmızı floresan protein ile etiketlenirken, erken Golgi protein Vrg4 GFP ile etiketlendiği bir gerginlik oluşturarak görselleştirilebilir. Bireysel sarnıt takip edildiğinde, olgunlaşma yeşil-kırmızı dönüşüm olarak görülür3. Bu tür analizler protein lokalizasyonu ve bölme kimliği hakkında değerli bilgiler verebilir. Örneğin, biraz uzaklık geliş ve kalkış süreleri ile iki protein bazen statik görüntülerde farklı bölmeleri etiketlemek için görünebilir, ancak 4d filmleri farklı zaman noktalarında aynı bölme etiket için görülebilir5/6 . Böylece, 4D mikroskopisi aksi belirgin olmazdı olayları ortaya çıkarır.
Maya bölmeler bilgilendirici 4D mikroskopisi uygun prosedürler ve ekipmanlar ile elde edilebilir2. Mümkün olduğunda, floresan protein etiketleme gen replasman tarafından gerçekleştirilir8 ekspresyonu eserler önlemek için. Hücre içi yapılar genellikle çok dinamik olduğundan, bir yapının zaman içinde güvenilir bir şekilde izlendiğinden emin olmak için 4D görüntüleme gereklidir. Burada açıklanan protokol, yüksek hassasiyet dedektörleri ile donatılmış bir lazer tarama Konfokal mikroskop kullanır. Bu cihaz ile, s. cerevisiae tüm hücre hacmi yaklaşık her 1-3 s, 2 s aralıklarla tipik olan konfokk mikroskopisi tarafından görüntülenmiş olabilir. Fluoropoerlerin ve fotofizik özelliklerinin etiketleme yoğunluklarına bağlı olarak 5-15 dakika kadar veri toplanabilir. Ana engel fotobleaching en aza indirmek için. Bu amaçla, lazer yoğunlukları mümkün olduğunca düşük tutulur, konfet tarama hızı maksimize edilir, ve optik parametreler aşırı ışık pozlama kaçınarak ilgili bilgileri yakalamak için Nyquist sınırına görüntü olarak yapılandırılır. Bu ayarların aynı zamanda fototoksisite hafifletmek için bekleniyor, genellikle canlı hücre görüntüleme sırasında gözardı edilen bir faktör9,10,11. Ortaya çıkan gürültülü veriler, floresan yoğunluklarını ölçmek için çamaşır suyu düzeltmesi ve deconvolution algoritmaları ile işlenir.
Yüksek kaliteli 4D filmler bile, Maya bölmeleri çok, heterojen ve mobil olma eğilimindedir çünkü analiz zordur. Konfokal mikroskopinin içsel sınırlamaları ve uzun süreli 4D görüntüleme için gerekli olmayan optimum ayarları nedeniyle, birbirlerine yakın olan floresan yapıları çözmek zordur. Bu sorun, etiketleme döneminin süresi için optik olarak çözülebilir kalır floresan yapıların az sayıda odaklanarak, bu yapıların etiketli tüm nüfusun temsilcisi olduğunu varsayımı ile kaçınılabilir Bölme. Güvenilir bir şekilde izlenebilir floresan bölmeleri, öngörülen Z yığınlarının filmleri görüntüleyerek ve her zaman noktası için optik bölümlerin bir bilgisayar ekranında dizilen bir dizi editörü oluşturarak tanımlanır. Bu analiz özel ımagej12 eklentileri kullanır ve bu da tek bir yapının izolasyonda izlenmesini sağlar.
Son Yöntemler kağıtları Maya floresan proteinleri kullanımı kapsanan13 yanı sıra teori ve Maya hücrelerinin 4d Konfokal görüntüleme uygulaması2. Bu protokol, 4D görüntüleme deneyinin temel pratik yönlerini üzerinde duruluyor. Daha önce açıklanan yordamların yanı sıra ımagej eklentisi kodunun ve belgelerinin güncelleştirilmiş sürümlerinin bazı geliştirmeleri içerir. Gösterilen örnek Golgi dinamiklerine odaklanır, ancak bu protokol diğer Maya bölmeleri görüntüleme için eşit derecede uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maya organelleri 4D Konfokal görüntüleme çoklu parametrelerin dikkatli ayarlama gerektirir. Büyük endişe fotobleaching ve fototoksisite. Tipik bir 4D film binlerce optik bölüm toplama içerir, böylece lazer aydınlatma mümkün olduğunca düşük tutulması gerekir. Tandem floresan protein etiketleri etiketli protein ifadesi artan olmadan sinyali artırmak için kullanılabilir16,17. Tarama hızını maksimize etmek, photodam sınırlamak için yardım…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NıH Grant R01 GM104010 tarafından desteklenmektedir. Vytas Bindokas ve Christine Labno, NıH destekli Kanser Merkezi Destek Grant P30 CA014599 tarafından desteklenen entegre mikroskobik çekirdek tesisi, floresans mikroskopisi ile yardım için teşekkürler.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
Referenzen
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).
