قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة
Summary
تظاهر هنا بروتوكولات لعزل (1) طازجة غشائي الدماغية سليمة “أنابيب” والقياسات (2) المتزامنة من الكالسيوم بطانية وغشاء المحتملة خلال المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب. علاوة على ذلك، تسمح هذه الأساليب لضبط الدوائي الكالسيوم غشائي الخلايا والإشارات الكهربائية كمتغيرات تجريبية فردية أو التفاعلية.
Abstract
شرايين المخ وعلى دوران الأوعية الدقيقة الخاصة بكل منها تسليم الأوكسجين والمواد المغذية إلى الدماغ عن طريق تنظيم تدفق الدم. خلايا بطانية خط التجويف الأوعية الدموية والتغييرات الأمر في قطر الأوعية الدموية اللازمة لتلبية الطلب على التمثيل الغذائي للخلايا العصبية. عادة ما تعمل الابتدائي غشائي تعتمد على مسارات إشارات من فرط الاستقطاب غشاء المحتملة (تم) وأكسيد النيتريك في نفس الوقت التوسط من أجل توسع الأوعية ومن ثم زيادة تدفق الدم. على الرغم من أن جزءا لا يتجزأ من تنسيق توسع الأوعية عبر عدة ملليمترات من طول الأوعية الدموية، كان من الصعب تاريخيا لقياس مكونات المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب (إده). هذه المكونات من إده تنطوي داخل الخلية Ca2 + [Ca2 +]أنا يزيد والتنشيط اللاحقة للصغيرة-والمتوسط الموصلية Ca2 +-تنشيط ك+ (كورونا/IKCaCa) القنوات.
وهنا، نقدم مثالاً مبسطة لعزله البطانة الطازجة من الماوس الشرايين الدماغية؛ قياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي؛ ومن سوبيرفوسيون مستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية في ظل الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). تتم إزالة الشرايين الدماغية الخلفية من “دائرة ويليس” مجاناً للاتصال اللاحق والشرايين باسيلار. ويسهل الهضم الأنزيمي لتنظيف القطع الشرياني الدماغي الخلفي واللاحقة تريتوريشن إزالة والبرانية وارتشاح الأعصاب وخلايا العضلات الملساء. الناتج الخلفي الدماغي الشرياني بطانية “أنابيب” ثم يتم تأمينها تحت مجهر ودرست باستخدام كاميرا، وأنبوب ضوئي، اليكتروميتيرس واحدة واثنين في حين ظل سوبيرفوسيون المستمر. جماعياً، في نفس الوقت يمكن قياس هذا الأسلوب التغييرات في غشائي [Ca2 +]أنا و الخامسم في مواقع الخلوية منفصلة، بالإضافة إلى انتشار إده عن طريق تقاطعات الفجوة حتى مسافات ملليمتر على طول حالها البطانة. هذا الأسلوب من المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق لمهام غشائي الدماغية الكامنة وراء آليات لتنظيم تدفق الدم في المخ العادي والمريضة.
Introduction
وينظم تدفق الدم في جميع أنحاء الدماغ تنسيق توسع الأوعية بين شرايين المخ والشرايين في شبكات الأوعية الدموية1. خلايا بطانية بطانة الشرايين المقاومة الدماغية الأمر التغييرات في قطر الأوعية الدموية حسب الحاجة لتلبية الطلب الأيضية للخلايا العصبية1،،من23. خلال فرط الاستقطاب المستمدة من البطانة (المعروفة عموما باسم إده)، على وجه الخصوص، كاليفورنيا داخل الخلية2 + ([Ca2 +]أنا) والإشارات الكهربائية في خلايا بطانية توسع الأوعية تنسيق بين خلايا بطانية وبهم خلايا العضلات الملساء المحيطة بها من خلال تقاطعات الفجوة للاسترخاء الشرايين4. الفسيولوجية بدء إده تسلسلياً يستلزم تنشيط ز-إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، زيادة في [Ca2 +]أنا، وتفعيل البطانية الصغيرة والمتوسطة Ca2 +-تنشيط ك+ (/IK كوروناالمرجع المصدقCa) القنوات هايبربولاريزي غشاء بطانة الأوعية الدموية الدماغية المحتملة (تم)5،،من67. وهكذا، العلاقة الحميمة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم جزء لا يتجزأ من تنظيم تدفق الدم ولا غنى عنه للقلب-والأوعية الدماغية وظيفة6،8. في جميع أنحاء الأدب أوسع نطاقا، والعديد من الدراسات أفادت رابطة خلل الأوعية الدموية غشائي مع تطور الأمراض المزمنة (مثل ارتفاع ضغط الدم، والسكري، قصور القلب، مرض الشريان التاجي، الفشل الكلوي المزمن، أمراض الشرايين الطرفية)9،10، مما يشير إلى أهمية دراسة الدالة غشائي في الظروف الفسيولوجية وكذلك المرضية.
البطانة الوعائية جزء لا يتجزأ من الإنتاج من فرط الاستقطاب، وتوسع الأوعية، ونضح الأنسجة وهكذا، دراسة خصائصه الخلوية الأصلية الحاسمة. كنموذج دراسة عامة، تم نشر إعداد نموذج أنبوب غشائي الشرياني الماوس قبل للهيكل العظمى والعضلات11،12،13من القناة الهضمية،14من الرئة، ومؤخرا ل الدماغ6. خاصة نشرت دراسات متزامنة [Ca2 +]أنا وقياساتm V للهيكل العظمى والعضلات البطانة الشريانية15،16 ، فضلا عن سفينة اللمفاوية البطانة17. وبالإضافة إلى الدراسات الأولية استخدام النهج أنبوب غشائي، يمكن الاطلاع على استعراض شامل لمزايا وعيوب8 تحديد ما إذا كانت هذه الأداة التجريبية المناسبة لدراسة محددة. باختصار، هي ميزة الاحتفاظ بالعناصر الفسيولوجية الرئيسية لوظيفة الخلايا البطانية (مثل، Ca2 + تدفق وإطلاق سراح داخل الخلايا، فرط الاستقطاب Vم تصل إلى الإمكانات] [نرنست] ك+ عن طريق كورونا/IKCaCa التنشيط، واقتران بين الخلايا البطانية عن طريق تقاطعات الفجوة) دون التباس عوامل مثل ارتشاح الأعصاب الإدخال ووظيفة القناة عن طريق بوابة الجهد العضلات الملساء وكونتراكتيليتي، دوران الدم، والتأثيرات الهرمونية8. وفي المقابل، نهج ثقافة الخلية المستخدمة عادة إدخال تعديلات هامة في مورفولوجيا18 وأيون قناة التعبير19 في طريقة إلى حد كبير يمكن أن تعتم مقارنات للملاحظات الفسيولوجية التي تحدد السابقين فيفو أو في فيفو. وتشمل القيود الافتقار إلى التكامل مع المكونات الأخرى الضرورية لتنظيم تدفق الدم، مثل العضلات الملساء والمرونة مقيدة في وضع جدول زمني تجريبية، كما يتم اختبار هذا النموذج الأمثل ضمن ح 4 من عزلة الجزء الأوعية الدموية سليمة من هذا الحيوان.
بناء من بروتوكول فيديو سابق من تأليف سوتشا وسيجال12 ومستجدات التجريبية المؤقتة6،،من1516، نثبت هنا عزلة البطانة جديدة من شرايين المخ الخلفي وقياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تستلزم هذه التجربة سوبيرفوسيون المستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية خلال الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). لقد اخترنا الشريان الدماغي الخلفي، كما غلة البطانة معزولة مع السلامة الهيكلية (الخلايا إلى جانب من خلال تقاطعات الفجوة) ويكفي الأبعاد (العرض إيه فايف زيرو ميكرومتر، طول إيه ثري زيرو زيرو ميكرومتر) قابلة لداخل وبين الخلايا مما يشير إلى طول وبين خلايا بطانية. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل إلى حد كبير في الأدب دراسات الشريان الدماغي الخلفي القوارض وتشمل دراسة آليات إرسال الإشارات غشائي الأساسية والأوعية الدموية التنمية/الشيخوخة، وعلم الأمراض20، 21 , 22-ومن المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق للدالة غشائي الدماغي (والخلل) هذا التطبيق التجريبي وسيسمح ذلك لأوجه التقدم الكبير في الفهم لتنظيم تدفق الدم في جميع أنحاء الشيخوخة وتطور المرض الأعصاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
ضوء الأخيرة تطورات6،15،،من1617، نظهر الآن طريقة لعزل الماوس البطانة الشريانية الدماغية تحضيرا لقياس متزامنة من [Ca2 +] الأول والخامسم الكامنة إده استمرار ح ~ 2 عند 37 درجة مئوية. على الرغم من صعوبة من الناحية…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر تشارلز هويت للمساعدة التقنية ممتازة حين وضع المعدات واللوازم الضرورية للبروتوكولات الحالية. ونحن نشكر الدكتور شون م. ويلسون وكريستوفر ويلسون، من مركز LLU “علم الأحياء في الفترة المحيطة بالولادة”، لتزويدنا بالمجهر المقلوب إضافية والكترومتر، على التوالي. دعمت هذه البحوث “المعاهد الوطنية للصحة” منحة R00-AG047198 (EJB) وأموال بدء التشغيل كلية جديدة “لوما ليندا مدرسة الطب في جامعة”. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Referenzen
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
- Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
- Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
- Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
- Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
- Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
- Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
- Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
- Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
- Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).
