세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Summary

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 “튜브” 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

Abstract

대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (V_m) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아^{2 +} [캘리포니아^{2 +}]_나 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아^{2 +}-K⁺ 를 활성화 (SK_Ca/IK_Ca) 채널.

여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 “튜브” 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_나 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 V_m 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.

Introduction

두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크¹arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경^1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아^{2 +} ([캘리포니아^{2 +}]_나) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완⁴통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 G_q의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아^{2 +}]_나, 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca^{2 +}의 활성화에서 증가-K^{활성화 +} (SK_Ca/IK_Ca) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (V_m)^5,,67. 따라서, 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 의 친밀 한 관계 혈액 흐름 조절에 필수적인 이며 불가결 하 심장-뇌혈관 기능^6,8. 광범위 한 문학에 걸쳐 다 수의 연구 개발 (예: 고혈압, 당뇨병, 심장 마비, 관상 동맥 질환, 만성 신부전, 만성 질환의 혈관 내 피 기능 장애의 협회 보고 주변 동맥 질환)^9,10, 생리 뿐만 아니라 병 적인 조건에서 내 피 기능 공부의 중요성을 나타내는.

혈관 내 피 hyperpolarization, 혈관 확장, 그리고 조직 관류의 생산에 필수적인 것 이며 따라서, 기본 셀룰러 속성의 검사는 중요 한. 일반 연구 모델로, 마우스 동맥 내 피 튜브 모델의 준비 게시 되었습니다 전에 골격 근^11,12, 창 자¹³,¹⁴, 폐 그리고 최근 뇌⁶. 동시 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 측정 연구 특히 골격 근육 동맥 내 피^15,16 뿐만 아니라 림프 혈관 내 피¹⁷출판 되었습니다. 내 피 튜브 접근을 이용 하 여 기본 연구, 뿐만 아니라 그것의 장단점과⁸ 의 종합적인 검토는이 실험 도구는 특정 연구에 적합 여부를 확인 하 상담 수 있습니다. 간단히는 장점은 내 피 세포 기능의 주요 생리 적인 구성 요소 유지 됩니다 (예:, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 intracellular 자료, hyperpolarization Nernst 잠재력까지 V_m 의 k⁺ 통해 SK_Ca/IK_Ca 활성화 및 내 피 세포 결합을 통해 간격 접속점) 혈관 주위 신경 입력, 부드러운 근육 전압-문이 채널 기능 및 수축, 같은 요인을 혼동 없이 혈액, 그리고 호르몬 영향⁸의 순환. 대조적으로, 일반적으로 사용 되는 세포 문화 접근 소개 형태학¹⁸ 및 이온 채널 식¹⁹ 크게 생리 적인 관측 비보 전 결정에 대 한 비교를 난독 처리할 수 있습니다 방식에서에 중요 한 변경 또는 vivo에서. 이 모델은 그대로 혈관 세그먼트 격리의 4 h 이내 테스트 최적으로 혈액의 흐름, 부드러운 근육과 실험 일정에 제한 된 유연성 등 규제에 대 한 다른 필수 구성 요소와 통합의 부족 등 동물.

Socha 및 시걸¹² 및 중간^6,,1516, 최근 실험 개발 저술로 이전 비디오 프로토콜에서 건물 이로써 설명에서 신선한 피 내 막의 절연 후부 대뇌 동맥 그리고 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극, 각각 사용 하 여 동시 측정. 또한,이 실험 생리 적인 조건 (pH 7.4, 37 ° C) 동안 소금 솔루션 및 약리 에이전트의 연속 superfusion를 수반 한다. 우리 후부 대뇌 동맥, 구조적 무결성 (셀 간격 접속점 통해 결합)와 충분 한 크기 (폭 50 µ m, 길이 ≥300 µ m) 내부 및 세포 신호 따라 중에 대 한 의무가 격리 endothelium 생성 선택 내 피 세포입니다. 또한, 설치류 후부 대뇌 동맥의 연구는 실질적으로 문학에서 나타내고 근본적인 내 피 신호 메커니즘, 혈관 개발/노화, 그리고 병 리^20, 의 시험을 포함 ^{21 , 22}.이 실험의 대뇌 내 피 기능 (기능 장애) 높은 처리량 분석을 얻을 것으로 예상 된다 애플리케이션과 통해 혈액 흐름의 이해에서 중요 한 발전 그로 인하여 허용 한다 노화 및 신경 질환의 개발

Protocol

다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 “가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물’ (8번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월)….

Representative Results

위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 …

Discussion

최근 개발^6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아^{2 +}]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. _i 및 V_m EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조⁶, 그림 1 참조)을 측정?…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55