단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석
Summary
여기는 접는, 전송 및 라이브 셀에 따라 단백질의 저하의 운동 분석을 허용 하는 일반적인 펄스-체이스 메서드에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
방사성 펄스-체이스 라벨 구조적 성숙, 그들의 기능 세포 위치와 라이브 셀에 대상 단백질의 저하를 전송 위한 강력한 도구입니다. 짧은 (펄스) radiolabeling 시간을 사용 하 여 (< 30 분) 체이스 시간을 엄격 하 게 제어 하 고 총 단백질 풀의 극히 일부에 고의 접는 따라 수. Nonreducing/감소 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 immunoprecipitation (나 란 특정) 항 체와 결합 될 때 프로세스를 접는 훌륭한 세부 사항에서 시험 될 수 있다. 이 시스템 단백질 용 해 단백질, 단일 및 멀티 패스 막 횡단 단백질, 무 겁 게 N 및 O 당화 단백질, 속성에 거 대 한 변화 및 광범위 한 이황화 없이 단백질의 폴딩 분석 하는 데 사용 되었습니다. 결합. 펄스 추적 방법 등 공동 및 posttranslational 수정, oligomerization, 중 합, 근본적으로 죽음에 출생에서 단백질의 분석을 수 있도록 추가 기능의 범위에 활동적인 연구의 기초입니다. 단백질 폴딩에 펄스 체이스 학문은 증가 시간적 해상도 생리 적인 정보를 제공 하 여 단백질에서 생체 외에서 공부에 대 한 생화학 및 생물 다른 방법으로 보완. 이 문서에서 설명 된 대로 메서드는 포유류 나 곤충 세포 시스템에서 표현할 수 있는 거의 모든 단백질 폴딩 공부를 쉽게 적응 됩니다.
Introduction
심지어 상대적으로 간단한 단백질의 폴딩 포함 많은 다른 접는 효소, 분자 보호자, 화학식 수정1. 이러한 프로세스에서 생체 외에서 의 완전 한 재구성 실질적으로 불가능 하다, 관련 된 다른 구성 요소의 광대 한 번호. 그것은 매우 바람직한, 그러므로, 라이브 셀에서 vivo에서, 접히는 단백질을 공부 하입니다. 방사성 펄스-체이스 기술을 증명 합성, 접는, 전송, 그리고 그들의 자연적인 환경에 있는 단백질의 공부를 위한 강력한 도구.
대사 35S 표시 된 메티오닌 시스테인과 짧은 펄스 동안 단백질의 라벨, 방사성 라벨의 부재에 체이스 뒤, 넓은 셀룰러 환경에서 새로 합성된 단백질의 인구의 특정 추적을 수 있습니다. 그리고 대상 단백질 격리 를 통해 immunoprecipitation 수 분석을 통해 SDS 페이지 또는 다른 기술. 많은 단백질에 대 한 셀을 통해 그들의 여행은 SDS 페이지 젤에 표시 되는 수정에 의해 표시 됩니다. 예를 들어 골 복잡 한 당화 단백질 바인딩과 그물 (응급실)에서 교통은 종종 함께 N 연결 된 glycans의 수정 또는 O 연결 glycans2,3의 추가 합니다. 이러한 수정 이동성 변화 SDS 페이지에 의해 볼 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 큰 증가 일으킬. 성숙 신호 펩 티 드 분열 등 프로-펩 티 드, SDS 페이지 젤4에 쉽게 따라 할 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 변화 결과로 제거 분해 분열에 의해 표시할 수 있습니다. 방사능 어디 소설 단백질 합성 방지, 긴 치료 세포에 독성 그리고 더 오래 된, 안정 상태에서 단백질의 대부분을 제외 하지 마십시오 cycloheximide 추격전 같은 유사한 기술에 비해 상당한 장점을 있는 분석, 일부 단백질 일의 반감기를가지고. 모두 nonreducing에서 단백질의 비교 조건 감소 고 이황화 결합 형성, 많은 분 비 단백질4,,56, 의 폴딩에 중요 한 단계 분석 7.
여기 우리가 방사성 펄스-체이스 방식을 사용 하 여 단백질 폴딩과 그대로 셀에 수송의 분석에 대 한 일반적인 방법을 설명 합니다. 우리로 방법을 제공 하는 목적으로 하는 동안, 가능한 상세한 프로토콜 적응성에 대 한 거의 무한 한 잠재력이 고 각 독자의 특정 단백질 공부를 최적화 하면.
두 개의 다른 펄스-체이스 프로토콜, 부착 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.1)와 현 탁 액 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.2) 제공 됩니다. 조건을 제공 여기 중간-높은 식 수준으로 표현 되는 단백질을 시각화 하기에 충분. 독자가 제대로 표현한 단백질 또는 여러 immunoprecipitations 등의 다양 한 posttreatment 조건으로 작동 하는 경우 그것이 접시 크기를 늘리거나 셀 번호를 적절 하 게 필요 합니다.
서 스 펜 션 펄스 체이스, 체이스 샘플 각 시간 지점에서 찍은 모두에서 가져옵니다 셀의 단일 튜브. 세척 단계 후 펄스는 생략; 대신, 추가 35S의 레이블이 메티오닌과 시스테인의 높은 과잉을 가진 희석에 의해 방지 된다.
제시 프로토콜 세포질 단백질 접히는 과정에 따라 방사성 35S 표시 된 시스테인 그리고 메티오닌을 사용 합니다. 연산자와 환경 방사능 방사선에의 한 노출을 최소화 하 여 지정 된 실험실에서 수행 될 적절 한 보호 조치를 사용 하 여 방사성 시 약으로 모든 작업을 수행 되어야 합니다. 펄스-체이스로 기술 라벨은 상대적으로 효율적인 짧은 펄스 시간에 (< 15 분), 방사능의 시작 금액의 1%는 새로 합성된 단백질에 포함 하는 보다는 더 적은. Immunoprecipitation 통해 대상 단백질의 농축 후 방사능의 시작 금액의 0.05% 미만 SDS 페이지에 대 한 샘플에 포함 되어 있습니다.
35S 메티오닌과 시스테인 믹스 라벨 안정화는, 비록 일부 분해, 휘발성 방사성 화합물, 저조한 발생 합니다. 연구원 및 기구를 보호 하기 위해 몇 가지 예방 조치는 취해야 한다. 연구원 항상 로컬 방사선 안전 규칙을 순종 해야 하 고 숯 마스크 실험실 외 투와 (더블) 장갑 외에 간호를 입을 수 있습니다. 증기 두건에서 또는 로컬 포부 지점에서 35S 메티오닌과 시스테인 재고 튜브 항상 열 수 있습니다. 알려진된 실험실 오염 명소 원심 분리기, 펫, 물 욕, 인큐베이터 및 동영상 있습니다. 차콜 필터, 긍정적인 물개 microcentrifuge 튜브 ( 재료의 표참조), 펄스-체이스 요리에 붙어 물 목욕, 숯 필터 종이에 목탄 수족관 스폰지 피 펫 팁을 사용 하 여이 분야의 오염 감소 목탄 가드 포부 시스템 및 요리 incubators 및 스토리지 컨테이너에 숯 곡물의 배치.
Protocol
Representative Results
Discussion
펄스 추적 방법 그대로 셀에 접히는 단백질의 과학자 들의 이해를 개발 하기 위한 필수 되었습니다. 우리가 가능한 일반적인 방법을 제공 하기 위해 시도 하 고,이 이렇게 공부 접는, 전송, 그리고 단백질의 인생 셀 내부를 하는 동안 발생 하는 다양 한 프로세스를 거의 무한 한 변이 위한 잠재력이 있다.
요리에 부착 세포를 사용 하 여 펄스 체이스를 수행할 때 각 접시 같은 별…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 및 그들의 유익한 토론에 대 한 제시 고이 문서에서 제공 하는 방법 개발에 도움이 과거 Braakman 연구소의 모든 구성원을 감사 합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7 2007-2013 년) N ° 235649 아래 유럽 연구 위원회와 네덜란드 조직의 과학적 연구 (NWO) 에코 프로그램 N ° 711.012.008 아래에서 자금을 받았다.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referenzen
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