Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.
Abstract
Pulso-perseguição radioativo rotulagem é uma poderosa ferramenta para estudar a maturação conformacional, o transporte para sua localização celular funcional e a degradação de proteínas do alvo em células vivas. Com curto (pulso) radioativos vezes (< 30 min) e rigidamente controlado tempos de perseguição, é possível rotular apenas uma pequena fração da piscina proteína total e siga sua dobradura. Quando combinado com os/redução electroforese do gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e imunoprecipitação com anticorpos (conformação específicos), processos de dobramento pode ser examinado em grande detalhe. Este sistema tem sido usado para analisar o dobramento de proteínas com uma enorme variação nas propriedades, tais como proteínas solúveis, proteínas transmembrana única e multi-pass, fortemente glicosilados N – e O proteínas e proteínas com e sem bissulfeto de extensivo criar laços. Pulso-perseguição métodos são a base de estudos cinéticos em uma gama de recursos adicionais, incluindo co – e modificações do posttranslational oligomerização e polimerização, essencialmente, permitindo a análise de uma proteína desde o nascimento até a morte. Estudos de pulso-perseguição no enrolamento de proteínas são complementares com outros métodos de bioquímicos e biofísicos para estudar proteínas em vitro , fornecendo informações fisiológicas e maior resolução temporal. Os métodos descritos dentro deste papel adaptam-se facilmente para estudar o dobramento de quase qualquer proteína que pode ser expressa em sistemas de mamíferos ou inseto-célula.
Introduction
A dobradura do mesmo relativamente simples proteínas envolve muitas enzimas diferentes de dobramento moleculares chaperones e modificações covalentes1. Uma reconstituição completa destes processos em vitro é praticamente impossível, dado o vasto número de diferentes componentes envolvidos. Portanto, é altamente desejável, para estudar a proteína dobra na vivo, em células vivas. Técnicas de pulso-perseguição radioativo provam uma poderosa ferramenta para estudar a síntese, dobradura, transporte e degradação de proteínas em seu ambiente natural.
A metabólica rotulagem de proteínas durante um curto pulso com 35S-rotulado metionina/cisteína, seguido de uma perseguição na ausência de um marcador radioativo, permite o acompanhamento específico de uma população de proteínas recém sintetizadas no meio de uma maior celular. Em seguida, proteínas alvo podem ser isolado através de imunoprecipitação e analisaram através de SDS-PAGE ou outras técnicas. Para muitas proteínas, sua viagem através da célula é marcada por modificações visíveis no gel de SDS-PAGE. Por exemplo, o transporte de proteínas glicosilados de retículo endoplasmático (ER) para o complexo de Golgi é muitas vezes acompanhado por modificações de N-ligados os glicanos ou a adição de O-ligados os glicanos2,3. Essas modificações causam grandes aumentos na massa molecular aparente, que pode ser vista por alterações de mobilidade em SDS-PAGE. Maturação também pode ser marcada por clivagens proteolíticas, tais como o peptídeo sinal clivagem ou a remoção de pro-peptídeos, resultando em mudanças na massa molecular aparente que possa ser seguido facilmente em gel de SDS-PAGE4. Radioactividade tem consideráveis vantagens sobre técnicas comparáveis como perseguições de cicloheximida, onde síntese proteica romance é impedida, como tratamentos mais longos são tóxicos para as células e não excluem a maioria das proteínas mais velhas, de estado estacionário do análise, como algumas proteínas têm meias-vidas de dias. A comparação de proteínas sob ambos os e reduzir as condições permite a análise da formação de ligação dissulfeto, um passo importante para a dobradura de muitas proteínas secretoras4,5,6, 7.
Aqui nós descrevemos um método geral para a análise de proteínas e transporte nas células intactas, usando uma abordagem de pulso-perseguição radioativo. Enquanto nós ter mirado para fornecer o método como detalhada quanto possível, o protocolo tem um potencial quase ilimitado para adaptabilidade e permitirá otimização estudar proteínas específicas de cada leitor.
São fornecidos dois protocolos alternativos de pulso-perseguição, um para as células aderentes (etapa 1.1 do protocolo aqui apresentado) e outra para células de suspensão (etapa 1.2 do protocolo aqui apresentado). As condições fornecidas aqui são suficientes para visualizar uma proteína expressada com níveis de médio a alto-expressão. Se o leitor está trabalhando com proteínas mal expressas ou várias condições pós-tratamento, como moleculas múltiplas, é necessário aumentar o tamanho do prato ou número de células adequadamente.
Para perseguição de pulso de suspensão, as amostras de perseguição em cada ponto de tempo são todos retiradas um único tubo de células. As etapas de lavagem após o pulso são omitidos; em vez disso, mais incorporação de 35S é evitada pela diluição com um elevado excesso de sem rótulo de metionina e cisteína.
Os protocolos apresentados usam radioativo 35S-rotulado cisteína e metionina para acompanhar os processos de enrolamento de proteínas celulares. Todas as operações com reagentes radioativos devem ser realizadas utilizando medidas de proteção adequadas para minimizar a exposição do operador e o ambiente de radiação radioativa e ser realizada em um laboratório designado. Como o pulso-chase rotulando técnica é relativamente ineficaz em momentos de pulso curto (< 15min), menos de 1% do montante inicial da radioatividade é incorporado em proteínas recém sintetizadas. Após o enriquecimento da proteína do alvo através da imunoprecipitação, a amostra para SDS-PAGE contém menos de 0,05% do montante inicial da radioactividade.
Embora a 35S metionina e cisteína, mistura de rotulagem é estabilizado, uma decomposição, produzindo compostos voláteis radioactivos, ocorrerá. Para proteger o pesquisador e o aparelho, devem ser tomadas algumas precauções. O pesquisador deve sempre obedecer as regras de segurança de radiação local e pode usar um carvão enfermagem máscara, além de um jaleco e luvas (duplas). Frascos de estoque com 35S metionina e cisteína sempre devem ser abertos em uma coifa, ou sob um ponto de aspiração local. Pontos de contaminação do laboratório conhecidos são centrífugas, pipetas, banhos de água, incubadoras e agitadores. A contaminação destas áreas é reduzida pelo uso de pontas de pipetas com um filtro de carvão, positivo-selo microcentrifuga tubos (ver Tabela de materiais), esponjas de aquário carvão em papéis de filtro água banhos, carvão colados nos pratos, pulso-perseguição guarda do carvão vegetal no sistema de aspiração e o posicionamento dos pratos contendo grãos de carvão em incubadoras e recipientes de armazenamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pulso-perseguição métodos têm sido essenciais para o desenvolvimento da compreensão dos cientistas de proteína nas células intactas de dobramento. Enquanto tentamos fornecer um método que é tão geral quanto possível, esta abordagem tem o potencial para variações quase ilimitadas estudar vários processos que ocorrem durante o dobramento, o transporte e a vida das proteínas dentro da célula.
Ao realizar uma perseguição de pulso usando células aderentes em pratos, é essencial …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer todos os membros do laboratório Braakman, passado e presente, para suas discussões frutuosos e ajudam a desenvolver os métodos apresentados neste artigo. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) N ° da União Europeia 235649 e Holanda organização de científico pesquisa (NWO) sob o eco-programa N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referenzen
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
