Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen
Summary
Detaillierte Protokolle für beide in vitro und in-Cell selektive 2′-Hydroxyl-Acylation von Primer Extension (Form) Experimente zur Bestimmung der sekundären Struktur der Pre-mRNA-Sequenzen von Interesse im Beisein einer RNA-targeting niedermolekularer analysiert werden in diesem Artikel vorgestellt.
Abstract
In den Prozess der Arzneimittelentwicklung kleiner Moleküle RNA-targeting wird Aufklärung der strukturellen Veränderungen auf ihre Interaktionen mit der Ziel-RNA-Sequenzen gewünscht. Wir bieten hier eine detaillierte in-vitro- und in der Zelle selektiv 2′-Hydroxyl Acylation von Grundierung Erweiterung (Form)-Protokoll, um die RNA Strukturwandel in der Gegenwart ein experimentelles Medikament für spinale Muskelatrophie (SMA), Überleben der Studie analysiert Motoneuron (SMN)-C2, und im Exon 7 des Pre-mRNA des SMN2 Gens. In in-vitro-Form eine RNA-Sequenz von 140 Nukleotide mit SMN2 Exon 7 von T7-RNA-Polymerase transkribiert, gefaltet in Anwesenheit von SMN-C2 und anschließend durch ein mildes 2′-OH Acylation Reagenz, 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid (NAI) geändert. Diese 2′-OH-NAI-Addukt weiter sondiert durch einen 32P-Label Grundierung Erweiterung und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) behoben. Im Gegensatz dazu erfolgt 2′-OH Acylation in der Zelle Form an Ort und Stelle mit SMN-C2 gebunden zelluläre RNA in lebenden Zellen. Die Pre-mRNA-Sequenz von Exon 7 im SMN2-gen, zusammen mit Form-induzierte Mutationen in der Primer-Extension wurde dann mittels PCR und Sequenzierung der nächsten Generation verstärkt. Vergleicht man die beiden Methoden, in-vitro-Form ist eine kostengünstigere Methode und erfordert keine Rechenleistung, Ergebnisse zu visualisieren. Jedoch weicht die in vitro Modell der Form abgeleitet RNA manchmal von der Sekundärstruktur in einem zellulären Kontext, wahrscheinlich durch den Verlust aller Interaktionen mit RNA-bindende Proteine. In ZELLFORM braucht keinen radioaktiven Material Arbeitsplatz und ergibt eine genauere RNA Sekundärstruktur im Zusammenhang mit zellulären. Darüber hinaus in der ZELLFORM ist in der Regel für eine größere Palette von RNA-Sequenzen (~ 1.000 Nukleotide) durch die Verwendung von Next Generation Sequencing, im Vergleich zu in-vitro-(~ 200 Nukleotide), die in der Regel zu gestalten setzt auf Seitenanalyse. Für den Fall, dass der Exon 7 in SMN2 Pre-mRNA, die in-vitro- und in der Zelle Form abgeleitet sind RNA-Modelle einander ähnlich.
Introduction
Selektive 2′-Hydroxyl Acylation analysiert durch Primer Extension (Form) ist eine Methode zur Messung der Kinetics von jedem Nukleotid in einer RNA-Sequenz des Interesses und Aufklärung der Sekundärstruktur bei Einzel-Nukleotid-Auflösung1. Form-Methoden, sowohl im in-vitro-Bedingungen2,3,4 (gereinigte RNA in einem definierten Puffersystem) und im lebenden Säugetier-Zellen5,6, wurden entwickelt, um die sekundäre untersuchen Struktur von mittlerer Länge RNA-Sequenzen (in der Regel < 1.000 Nukleotide in der Zelle Form und < 200 Nukleotide für in-vitro-Form). Es ist besonders nützlich, um Strukturveränderungen im Rezeptor RNA nach Bindung an RNA-Interaktion niedermolekularer Metaboliten2,4,7,8 bewertet und mechanistische Aktionen studieren RNA-targeting Moleküle während Drug Development9,10.
RNA-targeting Arzneimittelforschung hat vor kurzem Aufmerksamkeit in wissenschaftlichen Labors und der pharmazeutischen Industrie11,12 über unterschiedliche Ansätze und Strategien13,14,15 gezogen ,16. Jüngste Beispiele für RNA-targeting kleine Moleküle für den klinischen Gebrauch zwei strukturell verschiedene experimentelle Medikamente, LMI-07017 und RG-791618,19, für spinale Muskelatrophie (SMA), der viel versprechende zeigte Ergebnisse in Phase II Studien20. Beide Moleküle wurden gezeigt, die Ziel-Überleben der Motoneuron (SMN) 2 Pre-mRNA und regulieren das Spleißen Verfahren des SMN2 gen6,17,21. Die Anwendung von in-vitro- und in der Zelle Form in einer Untersuchung der Ziel-RNA strukturellen Veränderungen in der Gegenwart ein Analogon der RG-7916 bekannt als SMN-C26zuvor gezeigt.
Im Prinzip misst Form die 2′-OH Acylation bei jedem Nukleotid eine RNA-Sequenz im Beisein von überschüssigen Mengen an ein selbst abschrecken Acylation Reagenz unvoreingenommen. Das Acylation Reagenz ist nicht stabil im Wasser, mit einer kurzen Halbwertszeit von (z. B. T1/2 = 17 s 1-Methyl-7-Nitroisatoic-Anhydrid; oder 1 M 7, ~ 20 min für 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid, NAI)22 und Unempfindlichkeit gegen die Identität des die Basen-23. Dies führt zu einer günstigeren Acylation von 2′-OH-Gruppen der flexiblen Basen, die eine genaue Einschätzung der Dynamik der einzelnen Nukleotid umgewandelt werden können. Insbesondere ist ein Nukleotid in einem Base-paar in der Regel weniger reaktiv als eine ungepaarte man ein 2′-OH modifizierenden Reagenz, wie NAI und 1 M 7.
Mit Blick auf die Quelle der RNA-Vorlage und dem 2′-OH Acylation stattfindet, kann Form in der Regel in Form von in-vitro- und in-Cell kategorisiert werden. In Vitro Form verwendet gereinigtes T7 RNA transkribiert und es fehlt einen zellulären Kontext in experimentellen Designs. In ZELLFORM auftreten die RNA-Vorlage-Transkription und 2′-OH Acylation innerhalb lebender Zellen; Daher können die Ergebnisse der RNA Strukturmodell in einem zellulären Kontext rekapitulieren. In ZELLFORM wird für die Form, die in lebenden Zellen in der Literatur24durchgeführt wie in Vivo Form bezeichnet. Da dieses Experiment nicht in ein Tier durchgeführt wird, können wir dieses Experiment als ZELLFORM für Genauigkeit bezeichnet.
Auch unterscheiden sich die Strategien für die Grundierung Ausbaustufe von in-vitro- und in der Zelle Form. In in-vitro-Form hält reversen Transkription an die 2′-OH Acylation Position im Beisein von Mg2 +. Eine 32P-beschriftet-Grundierung-Erweiterung erscheint daher als eine Band in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Intensität der Band ist proportional zu der Acylation Satz1. In ZELLFORM, reversen Transkription generiert zufällige Mutationen bei der 2′-OH Addukt Position im Beisein von Mn2 +. Die Mutationszucht bei jedem Nukleotid durch in Tiefe Next Generation Sequencing erfasst werden kann, und die Form Reaktivität bei Einzel-Nukleotid-Auflösung kann dann berechnet werden.
Ein mögliches Problem für ZELLFORM ist die geringe Signal-Rausch-Verhältnis (d. h. ein Großteil der 2′-OH-Gruppen ist unverändert, während die unveränderten Sequenzen die meisten der Read in Next Generation Sequencing besetzen). Vor kurzem, eine Methode, um die 2′-OH anreichern RNA geändert, klicken Sie wie in Vivo Form (IcSHAPE) bezeichnet, entwickelte sich Chang Labor25. Diese Anreicherung-Methode kann bei der Untersuchung schwach kleine Moleküle wie RNA Interaktionen, vor allem in einem Verhör Transkriptom-weite vorteilhaft sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
In in-vitro-Form ist es wichtig, qualitativ hochwertige homogene RNA-Vorlage verwenden. T7-Transkription, liefert jedoch oft heterogenen Sequenzen36. Insbesondere sind Sequenzen mit ±1 Nukleotid am 3′-Terminus mit nicht zu vernachlässigenden Erträge36 in der Regel schwierig, durch Polyacrylamid-Gel Reinigung entfernt werden. Heterogene RNA-Vorlage kann dazu führen, dass mehr als ein Satz des Signals in die Sequenzierung Gel Profilierung der Grundierung Erweiterungsprodu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH R01-Zuschuss (NS094721, K.A.J.) möglich.
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Referenzen
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