Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения
Summary
Подробные протоколы для обоих в пробирке и в клеток селективного 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой грунтовка расширение (SHAPE) экспериментов для определения вторичную структуру пре мРНК последовательностей интерес присутствии малых молекул РНК таргетинг представленные в этой статье.
Abstract
В процессе разработки лекарственных средств малых молекул РНК таргетинг желательно изучение структурных изменений после их взаимодействия с РНК последовательности. Здесь мы предоставляем подробный в пробирке и в клеток селективного 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) протокол для изучения структурных изменений РНК в присутствии экспериментальный препарат для спинальной мышечной атрофии (SMA), выживание двигательных нейронов (SMN)-C2 и в экзона 7 пре мРНК гена SMN2. В пробирке формы последовательности РНК 140 нуклеотидов, содержащие SMN2 экзона 7 трансляции, полимераза T7 RNA, сложить в присутствии SMN-C2 и впоследствии изменена мягкая 2′-OH Ацилирование реагент, imidazolide 2-methylnicotinic кислота (NAI). Это 2′-OH-Най adduct далее зондируемой 32P-меченых грунтовка расширение и решены путем электрофореза геля полиакриламида (страница). И наоборот Ацилирование 2′-OH-элементная формы происходит на месте с SMN-C2 связаны клеточной РНК в живых клетках. Пре мРНК последовательность экзона 7 гена SMN2, наряду с формы индуцированной мутации в выдвижение праймера, затем был усиленный PCR и при условии соблюдения следующего поколения последовательности. Сравнение двух методологий, в пробирке форма является более экономически эффективным методом и не требуют вычислительной мощности для визуализации результатов. Однако в пробирке модель формы производные РНК иногда отличается от вторичной структуры в сотовой связи, вероятно из-за потери всех взаимодействий с RNA-связывая протеинов. В клеточной формы не нужно радиоактивного материала на рабочем месте и дает более точные вторичной структуры РНК в сотовой связи. Кроме того, форма в клеток обычно применяется для большего круга РНК последовательности (~ 1000 нуклеотидов) путем использования виртуализации нового поколения, по сравнению с в пробирке формы (~ 200 нуклеотидов), которая обычно основывается на анализе страницы. В случае, если экзона 7 в SMN2 пре мРНК, полученных in vitro и в клеток форму РНК модели схожи друг с другом.
Introduction
Селективный 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) — это метод измерения кинетики каждого нуклеотидов РНК последовательности интерес и выяснения вторичная структура единого нуклеотидом резолюция1. ФОРМУ методологии, оба в vitro условий2,3,4 (очищенная РНК в системе определенного буфера) и в живых клетках млекопитающих5,6, были разработаны для расследования на вторичном Структура средней длины РНК последовательности (обычно < 1000 нуклеотидов в ячейке фигуры и < 200 нуклеотидов в пробирке фигуры). Это особенно полезно для оценки структурных изменений в рецептор РНК после привязки к взаимодействующих РНК малые молекулы метаболиты2,4,,78 и учиться механистический действия молекул РНК ориентации во время наркотиков развития9,10.
РНК таргетинг лекарств недавно обращено внимание в научных лабораториях и в фармацевтической промышленности11,12 через различные подходы и стратегии13,14,15 ,16. Недавние примеры малых молекул РНК таргетинг для клинического использования двух структурно различных экспериментальных наркотиков, LMI-07017 и RG-791618,19, для спинальной мышечной атрофии (SMA), которые показали многообещающие результаты в фазе II клинических испытаний20. Обе молекулы были продемонстрированы цели выживания мотонейрона (SMN) 2 пре мРНК и регулировать процесс сращивания SMN2 ген6,17,21. Ранее мы продемонстрировали применение в пробирке и в клеток формы в рассмотрении целевой РНК структурных изменений в присутствии аналог RG-7916, известный как SMN-C26.
В принципе форма измеряет уровень 2′-OH Ацилирование каждого нуклеотидов РНК последовательности при наличии избыточного количества самостоятельно тушения Ацилирование реагента в непредвзято. Ацилирование реагент не является стабильным в воде, с коротким периодом полураспада (например, T1/2 = 17 s 1-метил-7-nitroisatoic ангидрид; или 1 M 7, ~ 20 мин на 2-methylnicotinic кислоты imidazolide, или Най)22 и нечувствительность к личности баз-23. Это приводит к более благоприятным Ацилирование 2′-OH-групп гибких оснований, которые могут быть преобразованы в точной оценки динамики Каждый нуклеотид. В частности нуклеотидов в паре базы обычно менее реактивно, чем один неспаренный для модификации реагента 2′-OH, Най и 1 M 7.
Глядя на источник шаблона РНК и где происходит 2′-OH ацилирование, форма обычно можно подразделить на форму in vitro и в клеток. В vitro формы использует очищенный T7 транскрипции РНК и не хватает сотовой связи в экспериментальные проекты. В-клеток форму шаблон транскрипции РНК и 2′-OH Ацилирование происходят в живых клеток; Таким образом результаты можно резюмировать структурная модель РНК в сотовой связи. В клеточной формы был передан как в естественных условиях формы для формы, в живых клетках в литературе24. Поскольку этот эксперимент выполняется не в животное, мы назвать этот эксперимент как форму в ячейке для точности.
Стратегии для этапа расширения грунт в пробирке и в клеток формы также отличаются. В пробирке форму обратной транскрипции останавливается в позиции Ацилирование 2′-OH присутствии мг2 +. Выдвижение праймера 32P-помечены таким образом появляется как группу в электрофореза геля полиакриламида (страница) и интенсивность группы пропорциональна Ацилирование скорость1. В-клеточной формы, обратная транскрипция генерирует случайные мутации в 2′-OH аддукт позиции присутствии Mn2 +. Мутационного скорость каждого нуклеотидов может быть захвачено в глубину секвенирование нового поколения, и форма реактивности в резолюции единого нуклеотидом затем может быть рассчитана.
Потенциальная проблема для фигуры в ячейке является низкое соотношение сигнал шум (то есть, большинство 2′-OH-групп неизмененным, в то время как неизмененное последовательности занимают большую часть read в последовательности следующего поколения). Недавно метод обогатить 2′-OH изменения РНК, упоминаемый как в естественных условиях щелкните ФИГУРУ (icSHAPE), был разработан в Чанг Лаборатория25. Этот метод обогащения может быть выгодным в изучении слабых малых молекул, таких как РНК взаимодействия, особенно в ходе допросов транскриптом широкий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В форме в лабораторных условиях важно использовать высокое качество однородной РНК шаблон. Однако, транскрипции T7, часто дает разнородные последовательности36. Особенно последовательности нуклеотидов ±1 на 3′-Отель terminus с не ничтожно малый урожайности36 обычно …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стало возможным благодаря НИЗ R01 Грант (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Referenzen
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
