Подробные протоколы для обоих в пробирке и в клеток селективного 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой грунтовка расширение (SHAPE) экспериментов для определения вторичную структуру пре мРНК последовательностей интерес присутствии малых молекул РНК таргетинг представленные в этой статье.
В процессе разработки лекарственных средств малых молекул РНК таргетинг желательно изучение структурных изменений после их взаимодействия с РНК последовательности. Здесь мы предоставляем подробный в пробирке и в клеток селективного 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) протокол для изучения структурных изменений РНК в присутствии экспериментальный препарат для спинальной мышечной атрофии (SMA), выживание двигательных нейронов (SMN)-C2 и в экзона 7 пре мРНК гена SMN2. В пробирке формы последовательности РНК 140 нуклеотидов, содержащие SMN2 экзона 7 трансляции, полимераза T7 RNA, сложить в присутствии SMN-C2 и впоследствии изменена мягкая 2′-OH Ацилирование реагент, imidazolide 2-methylnicotinic кислота (NAI). Это 2′-OH-Най adduct далее зондируемой 32P-меченых грунтовка расширение и решены путем электрофореза геля полиакриламида (страница). И наоборот Ацилирование 2′-OH-элементная формы происходит на месте с SMN-C2 связаны клеточной РНК в живых клетках. Пре мРНК последовательность экзона 7 гена SMN2, наряду с формы индуцированной мутации в выдвижение праймера, затем был усиленный PCR и при условии соблюдения следующего поколения последовательности. Сравнение двух методологий, в пробирке форма является более экономически эффективным методом и не требуют вычислительной мощности для визуализации результатов. Однако в пробирке модель формы производные РНК иногда отличается от вторичной структуры в сотовой связи, вероятно из-за потери всех взаимодействий с RNA-связывая протеинов. В клеточной формы не нужно радиоактивного материала на рабочем месте и дает более точные вторичной структуры РНК в сотовой связи. Кроме того, форма в клеток обычно применяется для большего круга РНК последовательности (~ 1000 нуклеотидов) путем использования виртуализации нового поколения, по сравнению с в пробирке формы (~ 200 нуклеотидов), которая обычно основывается на анализе страницы. В случае, если экзона 7 в SMN2 пре мРНК, полученных in vitro и в клеток форму РНК модели схожи друг с другом.
Селективный 2′-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) — это метод измерения кинетики каждого нуклеотидов РНК последовательности интерес и выяснения вторичная структура единого нуклеотидом резолюция1. ФОРМУ методологии, оба в vitro условий2,3,4 (очищенная РНК в системе определенного буфера) и в живых клетках млекопитающих5,6, были разработаны для расследования на вторичном Структура средней длины РНК последовательности (обычно < 1000 нуклеотидов в ячейке фигуры и < 200 нуклеотидов в пробирке фигуры). Это особенно полезно для оценки структурных изменений в рецептор РНК после привязки к взаимодействующих РНК малые молекулы метаболиты2,4,,78 и учиться механистический действия молекул РНК ориентации во время наркотиков развития9,10.
РНК таргетинг лекарств недавно обращено внимание в научных лабораториях и в фармацевтической промышленности11,12 через различные подходы и стратегии13,14,15 ,16. Недавние примеры малых молекул РНК таргетинг для клинического использования двух структурно различных экспериментальных наркотиков, LMI-07017 и RG-791618,19, для спинальной мышечной атрофии (SMA), которые показали многообещающие результаты в фазе II клинических испытаний20. Обе молекулы были продемонстрированы цели выживания мотонейрона (SMN) 2 пре мРНК и регулировать процесс сращивания SMN2 ген6,17,21. Ранее мы продемонстрировали применение в пробирке и в клеток формы в рассмотрении целевой РНК структурных изменений в присутствии аналог RG-7916, известный как SMN-C26.
В принципе форма измеряет уровень 2′-OH Ацилирование каждого нуклеотидов РНК последовательности при наличии избыточного количества самостоятельно тушения Ацилирование реагента в непредвзято. Ацилирование реагент не является стабильным в воде, с коротким периодом полураспада (например, T1/2 = 17 s 1-метил-7-nitroisatoic ангидрид; или 1 M 7, ~ 20 мин на 2-methylnicotinic кислоты imidazolide, или Най)22 и нечувствительность к личности баз-23. Это приводит к более благоприятным Ацилирование 2′-OH-групп гибких оснований, которые могут быть преобразованы в точной оценки динамики Каждый нуклеотид. В частности нуклеотидов в паре базы обычно менее реактивно, чем один неспаренный для модификации реагента 2′-OH, Най и 1 M 7.
Глядя на источник шаблона РНК и где происходит 2′-OH ацилирование, форма обычно можно подразделить на форму in vitro и в клеток. В vitro формы использует очищенный T7 транскрипции РНК и не хватает сотовой связи в экспериментальные проекты. В-клеток форму шаблон транскрипции РНК и 2′-OH Ацилирование происходят в живых клеток; Таким образом результаты можно резюмировать структурная модель РНК в сотовой связи. В клеточной формы был передан как в естественных условиях формы для формы, в живых клетках в литературе24. Поскольку этот эксперимент выполняется не в животное, мы назвать этот эксперимент как форму в ячейке для точности.
Стратегии для этапа расширения грунт в пробирке и в клеток формы также отличаются. В пробирке форму обратной транскрипции останавливается в позиции Ацилирование 2′-OH присутствии мг2 +. Выдвижение праймера 32P-помечены таким образом появляется как группу в электрофореза геля полиакриламида (страница) и интенсивность группы пропорциональна Ацилирование скорость1. В-клеточной формы, обратная транскрипция генерирует случайные мутации в 2′-OH аддукт позиции присутствии Mn2 +. Мутационного скорость каждого нуклеотидов может быть захвачено в глубину секвенирование нового поколения, и форма реактивности в резолюции единого нуклеотидом затем может быть рассчитана.
Потенциальная проблема для фигуры в ячейке является низкое соотношение сигнал шум (то есть, большинство 2′-OH-групп неизмененным, в то время как неизмененное последовательности занимают большую часть read в последовательности следующего поколения). Недавно метод обогатить 2′-OH изменения РНК, упоминаемый как в естественных условиях щелкните ФИГУРУ (icSHAPE), был разработан в Чанг Лаборатория25. Этот метод обогащения может быть выгодным в изучении слабых малых молекул, таких как РНК взаимодействия, особенно в ходе допросов транскриптом широкий.
В форме в лабораторных условиях важно использовать высокое качество однородной РНК шаблон. Однако, транскрипции T7, часто дает разнородные последовательности36. Особенно последовательности нуклеотидов ±1 на 3′-Отель terminus с не ничтожно малый урожайности36 обычно …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа стало возможным благодаря НИЗ R01 Грант (NS094721, K.A.J.).
DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
ChemiDoc | Bio-Rad | ||
T4 PNK | NEB | M0201S | |
γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
FuGene HD | Promega | E2311 | |
TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
NextSeq500 | Illumina | ||
NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |