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Biotechnik

オレイン酸のトリペプチド安定ナノエマルション

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

このプロトコルでは、リジン ・ チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-platinum(II) 共役のナノエマルションを合成するための効率的な方法について説明します。穏やかな条件合成を介しての自己集合、KYF と共役ナノエマルション フォーム。

Abstract

オレイン酸 acids-Pt(II) コアとリジン-チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) コーティング (KYF Pt NE) から成るナノエマルションを生成する方法について述べる。KYF Pt NE は、107 ± 27 nm と負の表面電荷の直径を有する 10 重量 % で Pt(II) をカプセル化します。KYF Pt NE は安定した水と、血清と生物学的活性します。KYF に fluorophore の活用により生体イメージングに適した蛍光ナノエマルションの合成ができます。水溶液環境と短い KYF ペプチドおよびオレイン酸 acids-platinum(II) 共役の自己集合による KYF Pt NE フォームで、ナノエマルションの合成を行います。自己組織化プロセスは、ソリューションの温度、基板のモル比と基質添加の流量に依存します。重要なステップは、合成の際に最適な撹拌速度を維持し、自己組織化のための十分な時間を許可する、ナノエマルションを遠心濃縮器に徐々 に集中して事前に含まれます。

Introduction

近年では、ナノ粒子ドラッグデリバリーとバイオ1,2,3,4としてこのような医用工学における関心の高まりがあった。ナノ粒子ベースのシステムの多面的機能はしばしば 1 つの定式化の内で複数のコンポーネントを組み込むことを必要とします。しばしば脂質またはポリマーに基づくビルディング ブロックは、その物理化学的特性、生体適合性、生分解性は、最終的にナノ構造1,の機能に影響を与える可能性があります点で異なる5,6。タンパク質やペプチドなどの生物学的派生材料は長い多機能ナノ構造、シーケンス柔軟性7,8のための有望なコンポーネントとして認識されています。非常に発注された超分子構造体形成ヘリカルに自己組み立てるペプチド リボン9,10、線維性足場11,12、および多く、従って建物への道を舗装生体分子ベースのハイブリッド ナノ構造をボトムアップ型を使用してのアプローチ13。

ペプチドは、医学やバイオ テクノロジー、特に抗がん剤療法14と抗生物質開発16,17、代謝と心血管疾患15同様のアプリケーションに検討されています。障害18、および感染症19。小さなペプチドによる治療受けている臨床試験20数百以上あります。ペプチドは、簡単を変更して高速に低コストで合成しています。さらに、彼らはその生物学・薬学アプリケーション21,22を容易に大きく生分解されます。ペプチド構造部材としての使用を含む、ペプチド ベースの応答性ナノ粒子の放出制御23,24,25,26のハイドロゲル デポ工学,27ペプチドを用いたバイオ センサー28,29,30,31, またはバイオ電子デバイス32,33,34。重要なは、フェニルアラニンを含む 2 つまたは 3 つのアミノ酸残基とも短いペプチッドはガイドに発見された、自己集合35,36,37を処理し、安定したエマルジョン38 を作成します.

彼らの高効率により、プラチナ ベースの薬は、両方単独でそして他のエージェント39,40との組み合わせで多くのがんの治療で使用されます。白金化合物は、monoadducts、intrastrand または interstrand のクロスリンクを形成し DNA 損傷を誘発します。Pt DNA 損傷は細胞機械装置によって認識され、修復されていない場合は細胞をアポトーシスに導きます。Pt(II) が癌細胞の死に貢献、最も重要なメカニズムは、DNA 転写41,42の抑制です。ただし、重篤な副作用を発生させる Pt(II) の全身毒性によってプラチナ療法の利点は減少します。これ Pt(II)43, で、しばしば DNA に達するプラチナのサブ治療濃度の低い臨床投与に します。結果として、次の DNA 修復はがん細胞の生存と Pt(II) 抵抗性の獲得に貢献します。プラチナ化学療法抵抗は、抗がん剤療法と治療障害44,45の主な原因主な問題。

全身循環のシールド効果を提供するためにおよび Pt II による副作用を軽減するため、Pt(II) エージェントをカプセル化する安定したナノシステムを開発しました。システムは、ナノエマルション (KYF Pt NE)46を形成する KYF トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-Pt(II) のコアに基づいています。KYF Pt 北東、オレイン酸と同様に、トリペプチドのアミノ酸のビルディング ブロックは、食品医薬品局 (FDA) と一般認識として安全 (フォアグラ) ステータスを持っています。KYF Pt NE は、47nanoprecipitation メソッドを使用して準備されます。要するに、オレイン酸 acids-Pt(II) 共役は有機溶剤に溶解し、37 ° C で水の KYF ソリューション (図 1) に滴下し、KYF Pt 好中球エラスターゼの自己集合を許可するいくつかの時間のため、溶液を攪拌します。ナノエマルションは 10 kDa 遠心コンセントレーターに集中し、水で 3 回洗浄しました。Fluorophore と KYF の化学修飾により蛍光 FITC-KYF-白金-NE の合成、生体イメージングに適した。

Protocol

1. オレイン酸 Acids–Platinum(II) 共役の合成 シスプラチンの活性化 60 ° C で 50 mg (0.167 モル) 4 mL の水 (例えば、nanopure) にシスプラチンを中断します。 シスプラチンのソリューションに 0.5 mL の水にアグノ3滴 55.2 mg (0.325 ミリ モル) を追加し、60 ° C で少なくとも 2 時間の反応をかき混ぜる反応の進行状況を示す塩化銀の白色沈殿物を形成します。 活性化反応…

Representative Results

このプロトコルを使用して準備 KYF Pt NE の代表の TEM 像を図 2 aに示します。KYF Pt ファミコン、球状形態、よく分散していると均一の大きさの。KYF-白金-ファミコン、200 測定、最低 3 つの TEM 画像から直接測定のコア径は、107 ± 27 nm です。KYF-白金-NE、動的光分光法 (DLS) を使用して分析の流体力学的直径が 240 に発見された 0.156 の多分散性のイン?…

Discussion

ナノエマルション合成で重要な手順は、基板のモル比を調整、オレイン酸 acids–Pt(II) 追加中の温度と流量制御の維持、自己組織化のための十分な時間を提供すること、使用して製品を浄化、遠心濃縮器列。これらのパラメーターに影響を与える KYF Pt NE; の形態とサイズしたがって、特に適切なモル比を維持し、正しく合成条件を調整することが重要です。

ナノエマルシ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 は感謝して SC2CA206194 を付与国立がん研究所からの財政支援を認めます。競合する金銭的な利益が宣言されていません。

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
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