JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biotechnik

Трипептид стабилизированный Nanoemulsion олеиновой кислоты

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Этот протокол описывает эффективный метод синтеза nanoemulsion олеиновая acids-platinum(II) конъюгата, стабилизировалось с трипептид лизин тирозин фенилаланин (KYF). Nanoemulsion формы умеренный синтетических условиях через самостоятельной сборки KYF и сопряженное.

Abstract

Мы опишем способ получения nanoemulsion, состоящий из олеиновая acids-Pt(II) ядро и покрытие лизин тирозин фенилаланин (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE инкапсулирует Pt(II) на 10% веса, имеет диаметр 107 Нм ± 27 и отрицательный заряд поверхности. KYF-Pt-NE стабилен в воде и в сыворотке крови и биологически активен. Спряжение Флюорофор к KYF позволяет синтеза люминесцентных nanoemulsion, которая подходит для биологической обработки изображений. Синтез nanoemulsion проводится в водной среде и KYF-Pt-NE форм через самосборки коротких пептида KYF и олеиновая acids-platinum(II) конъюгата. Самостоятельной сборки процесс зависит от температуры раствора, молярное соотношение субстратов и скорость потока добавления субстрата. Важнейшие шаги включают поддержание оптимальной скорости перемешивания во время синтеза, разрешительные достаточное время для самостоятельной сборки и предварительно сконцентрировав nanoemulsion постепенно в центробежных концентратор.

Introduction

В последние годы наблюдается растущий интерес к инженерии наночастицы для таких биомедицинских приложений как поставки наркотиков и bioimaging1,2,3,4. Многофункциональность систем на основе наночастиц часто обусловливает необходимость включения нескольких компонентов в рамках одной разработке. Строительные блоки, которые часто основаны на липиды или полимеры отличаются с точки зрения их физико-химических свойств, а также их биосовместимости и способность к биологическому разложению, которое в конечном итоге может повлиять на функции наноструктурированных1, 5,6. Биоселективного материалы, такие как белки и пептиды, давно были признаны перспективным компоненты многофункциональных наноструктур из-за их гибкость последовательности7,8. Пептиды, самостоятельно собрать в весьма упорядоченный супрамолекулярные архитектуры, образуя цилиндрические лентами9,10, волокнистых подмостей11,12и многие другие, проложив тем самым путь к зданию снизу вверх наноструктур на основе биомолекулы гибридный подход к13.

Пептиды были изучены для приложений в области медицины и биотехнологии, особенно для противоопухолевой терапии14 и сердечно-сосудистых заболеваний15 а что касается антибиотик развития16,17, метаболический расстройства18и инфекции19. Существует более сотни малых пептид терапевтов проходят клинические испытания20. Пептиды легко изменить и быстро, чтобы синтезировать при низких затратах. Кроме того они являются биологически, что значительно облегчает их биологических и фармацевтических приложения21,22. Использование пептидов как структурных компонентов включает в себя техники реагировать, на основе пептида наночастиц и складов Гидрогель для контролируемого высвобождения23,24,25,26 , 27, биосенсоры на основе пептида28,,2930,31или био электронных устройств32,,3334. Важно отметить, что даже короткие пептиды с двумя или тремя аминокислотных остатков, которые включают фенилаланина были найдены для самостоятельной сборки процессов35,,3637 и создавать стабилизированные эмульсии38 .

Препараты на основе платины, ввиду их высокой эффективности, используются в многих схем лечения рака, как самостоятельно, так и в сочетании с другими агентами39,40. Платиновый соединений вызвать повреждение ДНК, образуя monoadducts и intrastrand или interstrand перекрестные ссылки. Pt-ДНК поражения распознаются клеточными и, если не отремонтированы, привести к сотовой апоптоз. Наиболее важный механизм, по которому Pt(II) способствует гибели клеток рака, является ингибирование транскрипции ДНК41,42. Однако преимущества платиновой терапии уменьшаются по системной токсичности Pt(II), что вызывает серьезные побочные эффекты. Это приводит к нижней клинических дозирование Pt(II)43, которая часто приводит к югу терапевтические концентрации платины, достигнув ДНК. Как следствие репарации ДНК, который следует способствует выживание клетки рака и приобретения Pt(II) сопротивления. Платиновый химио сопротивление является серьезной проблемой в противоопухолевой терапии и основной причиной неудачи лечения44,45.

Мы разработали стабильной наносистем, инкапсулирующий агент Pt(II) для того чтобы обеспечить защитный эффект в кровообращения и уменьшить побочные эффекты Pt II-индуцированной. Система основана на ядре олеиновая acids-Pt(II) стабилизированы с KYF трипептид сформировать nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Строительные блоки KYF-Pt-NE, аминокислоты, трипептид, так и олеиновой кислоты, имеют статус обычно признается как безопасное (GRAS) с продуктами питания и лекарствами (FDA). KYF-Pt-NE готовится с помощью метода nanoprecipitation47. Короче говоря олеиновая acids-Pt(II) конъюгата растворяется в органических растворителях и затем добавлены каплям водный раствор KYF (рис. 1) при 37 ° C. Раствор перемешивали за несколько часов, чтобы позволить самостоятельной сборки из KYF-Pt-NE. Nanoemulsion в основном в 10 кДа Центробежные концентраторы и три раза промывают водой. Химическая модификация KYF с Флюорофор позволяет синтеза люминесцентных FITC-KYF-Pt-NE для биомедицинских изображений.

Protocol

1. синтез конъюгата олеиновая Acids–Platinum(II) Активация цисплатин Приостановить 50 мг (0,167 ммоль) цисплатина в 4 мл воды (например, nanopure) при температуре 60 ° C. Добавить прикапывают 55.2 mg (0.325 ммоль) AgNO3 в 0,5 мл воды в раствор цисплатина и перемешать реакции для по крайней мере 2 ?…

Representative Results

Представитель ТЕА изображение KYF-Pt-NE приготовленные этот протокол будет показано на рисунке 2A. KYF-Pt-нес сферических в морфологии, хорошо рассеяны и одинаковыми по размеру. Диаметр сердечника KYF-Pt-нес, измеряется непосредственно из трех изображений ТЕА с …

Discussion

Важнейшие шаги в синтезе nanoemulsion включают корректировки молярное соотношение субстратов, контроль температуры и потока скорость во время добавления олеиновая acids–Pt(II), предоставляя достаточное время для самостоятельной сборки и очистки продукта с помощью Центробежный концентратор с?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы с благодарностью признаем финансовой поддержке Национального института рака, Грант SC2CA206194. Объявляются не конкурирующих финансовых интересов.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Krebsforschung. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Keywords: TripeptideNanoemulsionOleic AcidCisplatinPlatinumOvarian CancerPeptide ModificationDiagnosticPharmaceuticalIn-vivo StudiesFmocL-phenylalanineL-tyrosineTBTUDIPEA
check_url/de/59034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image