Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Abstract

Excesso de ingestão sal contribui para a inflamação e desempenha um papel vital no desenvolvimento da hipertensão. Encontramos anteriormente que apresentadoras de células dendríticas (DCs) podem sentido elevado de sódio extracelular, levando a formação de isolevuglandin (IsoLG) e a ativação da oxidase NADPH-proteína adutos. Estes IsoLG-proteína adutos reagem com autoproteínas e promover um estado de doença auto-imune e hipertensão. Temos desenvolvido e otimizado o estado-da-arte métodos para estudar a função DC na hipertensão. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento, em vitro tratamento com elevada de sódio e transferência adotiva de murino CD11c esplênica⁺ células em camundongos destinatários para estudar o seu papel na hipertensão.

Introduction

Excesso de sal dietético é um importante factor de risco para hipertensão. ^{1 , 2} the American Heart Association recomenda um máximo de 2.300 miligramas (mg) da ingestão de sódio (Na⁺) por dia, no entanto; menos de 10% da população dos EUA observa esta recomendação. ^{3 , 4} modestas reduções na ingestão de at⁺ baixar a pressão sanguínea e reduzem os anual de novos casos de doença coronariana e acidente vascular cerebral nos Estados Unidos em 20%. ⁵ um grande problema com o consumo de sal em excesso é que 50% da população de hipertensos apresenta sensibilidade ao sal, definida como um aumento de 10 mmHg na pressão de sangue após carregamento at⁺ ou uma queda semelhante na pressão arterial após at⁺ restrição e diurese. ⁶ sal-sensibilidade também ocorre em 25% dos indivíduos normotensos e é um preditor independente de eventos cardiovasculares e morte. ^{7 , 8} mecanismos de detecção sal na hipertensão, envolvendo o rim têm sido bem estudados; no entanto, estudos recentes sugerem que células do sistema imunológico podem sentir nd⁺. ^{9 , 10}

Recentes sugerem que as alterações em extra renal at⁺ manipulação podem causar acúmulo de at⁺ no interstício e promover inflamação. ^{11 , 12} nosso laboratório e outros têm mostrado que as células do sistema imune inato e adaptativo contribuem para a exacerbação da hipertensão. ^{9 , 13 , 14 , 15} vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e norepinefrina causa sal macrófagos, monócitos e linfócitos T para infiltrar o rim e a vasculatura e promover retenção Na⁺ , vasoconstrição, pressão arterial elevação e envolvimento visceral. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} em estudos anteriores, verificou-se que o DCs acumulam isolevuglandin (IsoLG)-proteína adutos em resposta aos vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e DOCA-sal hipertensão. ¹⁴ IsoLGs são altamente reativos produtos de peroxidação lipídica que rapidamente e covalentemente aduto de lisinas sobre proteínas e sua acumulação é associada com a ativação de DC. ¹⁴ recentemente estabelecemos que elevado at⁺ é um potente estímulo para IsoLG-proteína aduto formação em murino DCs.⁹ entrada de at⁺ em DCs é mediada através de transportadores sensíveis amilorida. At⁺ é então trocado por cálcio (Ca^{2 +}) através da /nome da CA^{2 +} trocador de at⁺. CA^{2 +} ativa a proteína quinase C (PKC), que ativa a oxidase de NADPH, levando ao aumento superóxido (O₂^{· –}) e IsoLG-proteína aduto de formação. ⁹ transferência adotiva de sal-expostos a DCs hipertensão de números primos em resposta a uma dose de sub pressor da angiotensina II. ⁹

Identificação de CD11c + DCs dos tecidos tem sido anteriormente limitada a imunohistoquímica e RT-PCR e isolamento de DCs tem sido limitado a célula Classificar por citometria de fluxo. Embora a classificação de célula do citometria de fluxo é um método poderoso para o isolamento de células do sistema imunológico, é caro, demorado e leva a um baixo rendimento de células viáveis. Portanto, otimizamos um protocolo passo a passo para a digestão do tecido, estimulação in vitro e transferência adotiva de CD11c⁺ DCs para estudar a hipertensão.

Protocol

Da Universidade de Vanderbilt institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (imprensa nacional de academias. Revista 2010). 1. isolamento de baços de ratos Preparar RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 50 µM β-Mercaptoetanol e 1% penicilina/estreptomicina. Eutanásia em 10 – 12 semana-velhos camundongo…

Representative Results

A Figura 1 representa um esquema dos passos descritos acima. Baços murino isolados são classificados para CD11c+ DCs por célula magnético classificação e banhado em mídia sal normal (NS; 150 mmol de NaCl) ou alta mídia sal (HS; 190 mmol de NaCl), por 48 h. CD11c+ DCs enviaram então são transferidos por retrô-orbital injeção de destinatário ratos ingênuos. Dez dias depois, os ratos são implantados com minipumps osmótica p…

Discussion

No actual protocolo, otimizamos os procedimentos para isolar CD11c⁺ DCs de baços de ratos e enviaram transferi-los para animais ingênuo para estudar o papel da DCs na hipertensão induzida por sal. Este protocolo pode ser adaptado para isolar e enviaram transferir outros subconjuntos de células imunes, incluindo macrófagos, monócitos e células do sistema imunológico adaptativas incluindo linfócitos T e B. Otimizamos o processo de digestão esplênica para alcançar a sobrevivência celular adequada e e…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030