Summary

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Abstract

Aşırı diyet tuz tüketiminizi iltihap için katkıda bulunur ve hipertansiyon gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce dendritik hücreler (DC) antijen sunan lider NADPH oksidaz aktivasyonu ve isolevuglandin (IsoLG) oluşumu için yükseltilmiş ekstraselüler sodyum hissedebiliyorum bulduk-protein adducts. Bu IsoLG protein tepki öz-proteinler ile adducts ve bir devlet gibi otoimmün ve hipertansiyon tanıtmak. Biz geliştirdik ve hipertansiyon işlevinde DC incelemek için state-of–art yöntemleri en iyi duruma getirilmiş. Burada, detaylı bir protokol yalıtımı için içinde sağlamak yüksek sodyum ve fare dalak CD11c evlat edinen transferi ile in vitro tedavi+ hücreleri hipertansiyon içindeki rollerine çalışmaya alıcı fareler içine.

Introduction

Aşırı diyet tuz hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür. 1 , 2 Amerikan Kalp Derneği en fazla 2,300 miligram (mg) sodyum (Na+) alımı günlük, ancak önerir; ABD nüfusunun % 10’dan daha az bu öneriye gözlemler. 3 , 4 mütevazı indirimleri Na+ alımı düşük kan basıncı ve Koroner kalp hastalığı ve inme ABD’de yıllık yeni olgu % 20 oranında azaltmak. 5 hipertansif nüfusunun % 50 tuz-duyarlılık, sergiler aşırı tuz tüketimi ile önemli bir sorun olduğunu Na+ yükleme veya benzer bir damla kan basıncında Nasonra aşağıdaki tansiyon 10 mmHg artış olarak tanımlanan + kısıtlama ve diyürez. 6 tuz-hassasiyet Ayrıca normotansif kişilerin % 25 oluşur ve ölüm ve kardiyovasküler olaylar bağımsız bir tahmin. 7 , 8 tuz algılama mekanizmaları böbrek içeren hipertansiyonda de incelenmiştir; Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bağışıklık hücreleri Na+hissi olabilir düşündürmektedir. 9 , 10

Son kanıtlar işleme değişiklikleri ekstra renal Na+ iltihabı teşvik ve interstitium Na+ birikimi neden olabilir gösteriyor. 11 , 12 bizim laboratuvar ve diğerleri doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemi hücrelerinin hipertansiyon alevlenmesi için katkıda göstermiştir. 9 , 13 , 14 , 15 Anjiyotensin II, norepinefrin ve tuz neden makrofajlar, monosit ve T lenfositleri böbrek ve damarlara sızmak ve teşvik Na+ saklama, vazokonstriksiyona, kan basıncı da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif bir çekim gücü, bakış açısını ve uç-organ hasarı. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 önceki çalışmalarda, DCs isolevuglandin (IsoLG) birikir bulduk-protein adducts Anjiyotensin II ve DOCA-tuz hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif uyaranlara yanıt olarak. 14 IsoLGs lysines üzerinde proteinler için hızla ve kovalent adduct büyük ölçüde reaktif lipid peroksidasyon ürünleri vardır ve onların birikimi DC harekete geçirmek ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda yükseltilmiş Na+ IsoLG-protein için güçlü bir uyarıcı olduğunu kurduk 14 adduct DCs.9 Na+ girmesinden DCs amiloride hassas taşıyıcıları aracılık ettiği antikorundan oluşumu. Na+ sonra kalsiyum (Ca2 +) Na+/Ca2 + Eşanjör üzerinden için değiştirilir. CA2 + protein kinaz C (PKC) artan süperoksit için (O2· –) önde gelen NADPH oksidaz etkinleştirir etkinleştirir ve IsoLG-protein adduct oluşumu. 9 yanıt olarak Anjiyotensin II alt pressor bir doz DCs asal hipertansiyon tuz maruz evlat edinen transferi. 9

CD11c tanımlaması+ DCs dan doku immünhistokimya ve RT-PCR ile daha önce sınırlı olmuştur, ve yalıtım DC’lerin Akış Sitometresi tarafından sıralama hücreye sınırlı olmuştur. Akış Sitometresi hücre sıralama bağışıklık hücreleri yalıtım için güçlü bir yöntem olsa da, pahalı, zaman alıcı ve hücrelerin bir düşük verim için yol açar. Bu nedenle, biz bir adım adım protokol doku sindirim, tüp bebek stimülasyon ve evlat edinen transferi CD11c için optimize+ hipertansiyon çalışmaya DCs.

Protocol

Vanderbilt Üniversitesi’nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi burada açıklanan yordamları onayladı. Fareler yer alan ve uygun olarak Kılavuzu bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal akademiler Press. için bakım Yeniden düzenlenen 2010). 1. yalıtım dalağı fare dan 1640 RPMI hazırlayın: FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin. 10-12 hafta ötenazi-CO2 Solunduğ…

Representative Results

Şekil 1 bir şematik yukarıda açıklanan adımları temsil eder. İzole fare dalağı CD11c için sıralanır+ DCs sıralama ve normal tuz ortamları (NS; 150 mmol NaCl) veya yüksek tuz medya (HS; 190 mmol NaCl) 48 h. CD11c kaplama manyetik hücre+ DCs sonra adoptively retro-orbital tarafından aktarılır enjeksiyon saf alıcı fareler için. On gün sonra 14 gün boyunca düşük doz Anjiyotensin II (140 ng/kg/dk) infüzyon için o…

Discussion

Geçerli protokol yordamlar CD11c yalıtmak için optimize edilmiş+ DCs dalağı fareler ve adoptively onları DCs rol tuz kaynaklı hipertansiyonda çalışmaya naif hayvanlar içine transfer. Bu iletişim kuralı yalıtmak ve adoptively makrofajlar, monosit ve T ve B lenfositleri de dahil olmak üzere edinilmiş bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücre alt kümeleri aktarmak için adapte edilebilir. Biz yeterli hücre hayatta kalma ve istikrar DC yüzey ifade işaretley…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser tarafından desteklenen Amerikan Kalp Derneği için N.R.B. POST290900 verir, 17SDG33670829 L.X. ve ulusal sağlık Enstitüleri vermek K01HL130497 için A.K.

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

Referenzen

  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

View Video