Summary
눈 microvascular 침대의 프로테옴 특성은 인 간에 있는 많은 눈 병 리의 깊이 있는 이해를 위해. 이 연구에서는 단백질 추출 및 질량 분석 기반 proteomics 분석 모델 선박으로 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥을 사용 하는 작은 혈관에서 샘플 준비, 급속 한, 효과적이 고 강력한 방법 보여 줍니다.
Abstract
격리 된 눈 혈관 고급 기술 접근을 사용 하 여 눈의 병 태 생리 상태를 해독 하기 위해 생체 외에서의 사용은 크게 특정 질병의 우리의 이해 확대. 질량 분석 (MS)-기반된 단백질 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 혈관 침대에서 단백질에 있는 변경은 해명 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, MS 분석 이전 샘플 준비 단계 재현할 결과 및 복잡 한 프로테옴의 깊이 있는 설명에 결정적 이다. 이것은 눈 microvessels, 분석에 사용할 수 있는 샘플의 크기는 종종 제한 됩니다 및 따라서, 최적의 단백질 추출에 대 한 도전 포즈의 준비를 위해 특히 중요 하다. 이 문서는 모범적인 retrobulbar 안구 혈관 베드 채용 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥에서에서 샘플 준비에 대 한 효율적인 신속 하 고 강력한 프로토콜을 제공 하기 위해 노력. 현재 메서드 맞추고 상쾌한 균질, 다음 샘플의 펠 릿에서 단백질 추출 절차 샘플 이전 1 차원 젤 전기 이동 법 및 펩 티 드 정화 원심 필터 장치 청소 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 선형 이온 함정 Orbitrap MS 시스템에서 레이블 없는 정량화에 대 한 단계. 이 방법은 눈 microvessels의 proteomics 분석을 위해 특별히 개발 되었습니다, 하지만 우리 또한 설득력 있는 증거는 그것 또한 채택 될 수 있다 쉽게 다른 조직 기반 샘플에 대 한 제공가.
Introduction
Proteomics, 어떤 허가 통합 및 탁월한 데이터 수집 능력의 분야에서 발전 크게 반영에서 특정 질병 조건 뿐만 아니라 기본 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해에 혁명을는 특정 세포 인구 또는 조직1,2,,34의 생리 적인 상태입니다. Proteomics 또한 때문에 감도 및 편견된 분석으로 최종 진단 및 예 후, 잠재적인 질병 마커의 식별을 용이 하 게 다른 눈 샘플의 안과 연구에 중요 한 플랫폼으로 입증 했다 입증 우아하게 많은 연구에 의해 최근 몇 년 동안, 우리의 일부를 포함 하 여1,5,6,7,8,,910. 그러나, 그것은 종종 특히 신뢰할 수 있는 비교 분석에 대 한 건강 한 개인에서 제어 자료에 대 한 필요성을 고려 하 고 윤리적인 이유로 proteomic 분석에 대 한 인간의 샘플을 얻기 어렵다. 다른 한편으로, 그것은 또한 충분 한 양의 최적의 안정적인 대량 spectrometric 분석에 대 한 샘플을 얻기 위해 도전입니다. 이것은 눈의 혈관 마이크로 등 대량 제한 생물 재료 특히 중요 합니다. 하나 같은 주요 retrobulbar 혈관 눈 피 흐름의 규정에서 중추적인 역할을 수행 하는 짧은 후부 속눈썹 동맥 (sPCA). 어떤 섭 동 또는이 혈관 침대에 이상이 녹 내장 및 nonarteritic 이전 허 혈 성 시 신경 병 (NAION)11 등 여러 가지 광경을 위협 질병의 병 인으로 이어질 수 있는 심각한 임상 영향에 발생할 수 있습니다. , 그러나 12.,이 동맥 침대 위에서 언급 한 단점 때문에 프로테옴 변화 elucidating 연구의 부족이 있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 집 돼지 (Sus scrofa 부채, Linnaeus 1758)로 떠오르고 있다 좋은 동물 모델 안과 연구 인간과 돼지13, 사이 높은 형태 론 적과 계통 발생 유사성 때문에 , 1415. 돼지 눈 샘플은 쉽게 사용할 수 있으며, 가장 중요 한 것은, 인간의 조직의 더 정확한 표현.
이 microvessels에서 효율적인 단백질 추출 및 분석에 대 한 음식을 장만 하는 방법론의 부족 뿐 아니라 눈, 이러한 혈관의 중요 한 역할을 고려 하면 우리가 이전 한 사내를 사용 하 여 돼지 sPCA의 프로테옴 특징 있다 프로토콜 귀착되 었 다 단백질16의 높은 숫자의 id입니다. 이 연구를 바탕으로, 우리는 추가 최적화 고 깊이 있는 설명 모델 조직으로 돼지 sPCA를 사용 하 여 샘플의 총계에서 프로테옴 분석 수 있는이 문서에서 우리의 방법론. 이 연구의 주요 목적은 질량 제한 눈 혈관에 대 한 MS 호환 방법론을 확립 하는, 이기는 하지만 우리는 설명된 워크플로 또한 광범위 하 게에 적용할 수 있는 다양 한 조직 기반 샘플 실질적인 실험 증거 제공.
그것은이 작은 양의 종합 프로테옴 분석에 대 한 자료에서 높은-품질 MS 호환 샘플의 준비를 위한 도구가 될 것 이다 상상.
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Protocol
동물 샘플을 사용 하 여 모든 실험 절차는 비전에서 연구를 위한 협회와 안과 (ARVO) 문을 사용의 동물 안과 및 비전 연구 기관 지침에 대 한 엄격한 준수에서 수행 했다. 이 연구는 실시 하 고 안 과학의 부, 대학 의료 센터 마인츠에 승인 했다.
참고: 시 신경 및 extraocular 조직 돼지 눈 신선한 로컬 도살 장에서 가져온 즉시 사후. Enucleated 눈 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)에 실험실으로 이송 되었고 즉시 사용. 그림 1에 표시 된 워크플로 고용의 도식 개요가입니다.
1입니다. 솔루션
- Krebs-Henseleit (K-H)를 준비 하려면 버퍼, 한 건조 하 고 깨끗 한 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 다음 화학 물질 (NaCl의 27.68 g, NaHCO3의 8.4 g, KCl의 1.4 g, MgSO4, 1.18 g와 KH2포4의 0.64 g)를 무게 및 1.47 g CaCl2 와 다른 관으로 포도의 8.0 g.
참고: 이러한 화학 물질의 분말 혼합물은 차가운 건조 한 장소에 저장 되어야 합니다. CaCl2 포도 당 분말 혼합 가장 신선한 습기와 응집의 흡수를 방지 하기 위해 준비가 되어 있습니다. - 준비를 추출 버퍼 2a 펠 렛 샘플, 시 약 A 막 횡단 단백질 추출에서의 추출 버퍼 2와 100 µ L의 믹스 100 µ L 당 200 µ L 키트 ( 재료의 테이블에에서 b 6 참조).
참고: Aliquot 작업 부분-20 ° C에서 저장소로 구성 된 추출 버퍼 2, 시 약 A와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 막 횡단 단백질 추출 키트의 구성 요소를 사용 하 여를 연장 한다. 반복 중지 및 재개를 하지 마십시오. 펠 렛 추출 절차의 시작 전에 실내 온도 (RT) 시 약을 녹여. - 암모늄 탄산염 (ABC, 100 mM) 솔루션을 준비, 이온된 물 50 mL에 ABC의 0.39 g을 분해.
- 10mm를 준비 하려면 1, 4-dithiothreitol (DTT) 솔루션, 100 mM ABC의 20 ml에서 DTT의 30 mg 분해.
- 55 m m Iodoacetamide (IAA) 솔루션을 준비, 100 mM ABC의 20 mL에서 IAA의 200 mg을 디졸브.
참고: IAA는 어둠 속에서 유지 되어야 한다. 빛에 민감한 솔루션 튜브 포장 알루미늄 호 일을 사용 합니다. - 10 mM ABC와 10%를 포함 하는 트립 신 버퍼를 준비 (vol / vol) 이기 (ACN). 20 µ g 13 ng / µ L 트립 신 작업 솔루션을 준비 하는 콘텐츠를 분해 하는 트립 신의의 한 유리병에 트립 신 버퍼의 1.5 mL를 추가 합니다.
참고: 제공 학년 수정 trypsin 시퀀싱 동결 건조 된과 사용까지-20 ° C에 저장 해야 합니다. - 펩타이드 추출 버퍼를 준비 하려면 ACN 5% 포 름 산의 1:2 (v/v) 혼합.
참고: 1.3-1.7 신선한 사용 직전 단계에서 모든 솔루션을 준비 하 고 사용 하지 않는 볼륨 삭제. - 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA), 혼합 준비 TFA의 10 µ L 이온된 물 10 mL로 한다.
2입니다. 짧은 후부 속눈썹 동맥의 격리
참고: 돼지 눈 앞쪽 (그림 2A) 및 후부 섹션 (그림 2B)으로 기본적으로 나누어져 있습니다.
- 얼음 처럼 차가운 K H 버퍼를 포함 하는 해 부 챔버에 눈 지구를 놓습니다. 조심 스럽게 잘라 거리 주변 근육과 조직을 날카로운가 위를 마요네즈의 한 쌍.
- 메스로 절 개 하 고 눈 앞쪽 및 후부 반으로 분리 될 때까지 한 쌍의 날카로운가 위를 마요네즈와 적도 면을 따라 세계를 잘라. 제거 가능한 표준 패턴 집게의 쌍을 사용 하 여 눈의 후부 절반에서 훨씬 유리 몸.
참고: 눈 세계의 2 개 반으로 분리 해 부 접시에 눈을 이동 하지 않고 쉽게 sPCA의 격리를 지원 합니다. 그러나,이 단계는 필수. 혈관 눈 세계를 열지 않고 격리 된 수도 있습니다. - 신중 하 게 눈의 후부 절반 아래로 핀 절 개 핀을 사용 하 여 아래로 망막 사이드와는 실험으로 향하도록 시 신경.
- 부드럽게 잘라 멀리 학생 욕실이 봄이 기본 retrobulbar 맥 관 구조를 폭로 시 신경을 둘러싼 결합 조직.
- SPCA는 sclera를 관통 하 고 원주 (그림 2C) 시 신경 머리를 둘러싸고 (5-8 분기) 사이의 혈관의 짧은 가지로 볼 수 있습니다. Paraoptic 및 주변 결합 조직 유형 5 정밀 핀셋과 욕실이 capsulotomy가 위 (그림 2D)의 쌍과 함께 원심 sPCA 격리 합니다.
참고: K H 버퍼 격리 절차 동안 차가운 유지 확인 합니다. 그것은 주위 온도 따라 20-30 분 마다 버퍼를 변경 하려면 좋습니다.
3. 샘플 준비
- 부드럽게 추가 뾰족한 타입 5 정밀 핀셋과 욕실이 capsulotomy가 위 아래는 stereomicroscope 사용 하 여 동맥 세그먼트에서 결합 조직을 제거 하 고 오염 물질을 제거 하 고 혈액 잔류물을 얼음 처럼 차가운 PBS에 격리 된 동맥을 씻어.
참고: 샘플은 다음 단계에 즉시 적용 되지 않습니다, 경우 스냅-동결 그들 액체 질소와-80 ° C에 게 추가 사용까지. - 풀 한 생물 복제를 얻고, 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 그들을 전송 하 고 무게 분석 균형을 사용 하 여 샘플을 두 눈에서 동맥.
- 각 튜브를 추가 다음 조직 단백질 추출 시 약 0.5 m m와 1.0 m m 지르코늄 구슬의 혼합물 (T-당; B7 테이블의 자료를 참조).
참고: T의 볼륨-당 샘플의 50 밀리 그램을 시 약 1 mL의 비율로 각 관에서 샘플의 무게에 따라 달라 집니다. 균질 1의 볼륨 비율에 대 한 튜브를 로드할 때 따라 엄지손가락의 일반적인 규칙: 1:2 = 샘플: 구슬: T-(그림 3A) 당. 비효율적인 균질 화를 방지 하기 위해 추출 버퍼와 구슬의 너무 작은 금액의 너무 큰 볼륨을 사용 하지 마십시오. - 믹서 균질 화기에 샘플 튜브를 로드 (D6 테이블의 재료에 참조). 2 분 및 속도 레벨 6에 타이머를 설정 하 고, 균질을 시작. 실행 후 샘플까지 완전 한 균질 및 반복에 대 한 샘플은 완전히 확인 (그림 3B) 무 균.
참고: 총 24 샘플 튜브의 한 실행에는 무 균 수 있습니다. 그것은 단백질 변성을 최소화 하기 위해 균질 과정 샘플을 차가운 유지 하는 것이 중요입니다. 이 연구에 사용 된 총알 믹서 균질 화기는 샘플을 차가운 유지 하는 고유의 냉각 기능이 있습니다. 아니 내부 냉각 기능이 균질 화기에서 사용할 수 있는 경우에 각 실행 사이 얼음에 샘플을 보관할 수 있습니다. - 신중 하 게 신선한 microcentrifuge 튜브 homogenate 플라스틱. 불용 성 단백질 및 수용 성 단백질을 포함 하는 별도 상쾌한 펠 렛을 4 ° C에서 20 분 동안 10000 x g 에서 샘플 원심 조심 스럽게 플라스틱는 상쾌한 밖으로 신선한 microcentrifuge 튜브에 펠 릿 레이어 (그림 3C)를 건드리지 않고.
참고: 추가 사용까지-80 ° C에 상쾌한와 펠 릿을 저장할 수 있습니다.
4. 펠 릿 소화
- 각 펠 릿 샘플을 추출 버퍼 2A의 200 µ L 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5 µ L를 추가 합니다. 여러 번은 피 펫으로 펠 릿을 일시 중단 합니다.
참고: 펠 릿에 추가 하기 전에 잘 추출 시 약을 혼합. 추출 절차에 걸쳐 RT에서 얼음 및 프로 테아 제 억제 물에 추출 버퍼 2A를 유지. -
초음파 균질 화기를 사용 하 여 완전히 균질 펠 릿.
- 60을 1 주기 진폭을 설정 합니다. 티타늄 (Ø 0.5 m m, 길이 80 m m), 작은 볼륨 (10-500 µ L)와 샘플의 균질에 대 한 적합 한 프로브를 사용 합니다.
- 펠 릿 및 추출 버퍼 혼합물에 프로브를 담가 그리고 초음파를 샘플 폭로 시작 버튼을 누릅니다.
- 펠 렛 덩어리는 완전히 무 균 때까지 샘플을 sonicate. 각 쥡니다 사이 몇 초 동안 일시 중지 합니다.
- 시각적으로 완전 한 균질에 대 한 확인 하십시오. 믹스는 homogenate 여러 번 아니 수 풀을 피 펫.
참고: 펠 렛 추출 절차는 균질 (그림 4) 중에 생성 된 열으로 인해 단백질 변성을 방지 하기 위해 얼음에 밖으로 실행 되어야 한다.
5. 샘플 청소 및 교환 버퍼
- 3 kDa 컷오프와 원심 필터 장치를 사용 하 여 참조 테이블의 자료에서 D3 수정 제조업체의 지침에 따라이 절차에 대 한 해당 되는 경우. 첫째, microcentrifuge 튜브 (필터 팩에서 제공)에 필터 장치를 삽입 합니다.
- 하나의 필터 장치 샘플 homogenate의 200 µ L 플라스틱 고 같은 필터에 이온된 수의 200 µ L를 추가 합니다. 안전 하 게 모자(그림 5).
- 장소 필터 단위 분리기 및 14000 x g 4 ° c.에서 15 분에 대 한 회전
- 원심 분리기에서 장치를 제거 하 고는 여과 액을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에서 샘플 집중을 포함 하는 필터 단위를 구분. 여과 액 (그림 5B)를 삭제 합니다.
- 필터에 이온된 수의 400 µ L을 추가 하 여 집중을 다시 구성. 5.3 및 5.4 3 번 단계를 반복 합니다. 조심 스럽게 플라스틱 깨끗 한 microtube로 '청소' 샘플 집중.
참고: 일반적으로, 200 µ L 원유 샘플 보장할 수 50 ~ 70 여과 후 농축의 µ L. - 나머지 샘플 homogenates 단계 5.1-5.5 반복 합니다.
6. 단백질 측정
- Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 사용 하 여 키트 (참조 테이블의 재료에 B5) 플레이트 리더에 sPCA 샘플의 상쾌한 및 펠 릿 분수의 단백질 농도 결정 하.
- 제조업체의 지침에 따라 한 1 mL 앰 풀 2 mg/mL BSA, 구성 된에서 알 부 민 표준 (BSA) 희석 (최종 BSA 농도 범위 2000 25 µ g/mL)를 준비 합니다.
- 각 BSA 표준 희석의 10 µ L 플라스틱 고 샘플 바닥이-96-잘 빠진 미 판의 각 음에 (상쾌한 및 펠 릿)를 복제 합니다.
- BCA 시 약 50 부분 BCA 시 약 A의 BCA 시 약 b 1 부분에 추가 하 여 작업 준비
참고: 준비에 앞서 각 측정에 필요한 작업 시 약의 총 볼륨을 계산 하 고 갓 샘플 및 분석 될을 표준 희석의 수에 따라 충분 한 볼륨을 준비. - 신중 하 게 각 음에 시 약을 작동 하는 BCA의 200 µ L 플라스틱. 커버는 미 판 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 562에서 흡 광도 측정 하는 냉각 후 rt 플레이트, 플레이트 리더에 nm (D13 테이블의 재료에 참조).
- 각 BSA 표준 농도 (µ g/mL)에 대해 생성 된 표준 곡선에 따라 달라 집니다, 샘플의 단백질 농도 결정 합니다.
7. 1 차원 젤 전기 이동 법 (1DE)
- (대 한 한 샘플) 표 1 에서 같이 1DE에 대 한 샘플을 준비 합니다. 피 펫 잘 샘플 혼합 믹스. 15 분 및 실시간 멋진 70 ° C에서 샘플을 열
- 950 mL 이온된 물 50 mL MES SDS 실행 버퍼를 추가 하 여 실행 버퍼 x 1을 준비 합니다. 잘 믹스.
-
캐스트 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (자료의 테이블에 b 4를 참조)를 준비 합니다.
- 젤 카세트 제거 하 고 카세트 이온된 물으로 린스를 플라스틱 주머니 오픈 컷.
- 한 움직임, 우물을 손상 하지 않도록 주의 복용에 젤 카세트에서 빗을 제거 합니다.
- 부드럽게 로드 웰 스는 피 펫을 사용 하 여 실행 버퍼 x 1와 2-3 번 씻어. 반전 하 고 부드럽게 제거 되도록 거기 우물에서 없음 기포 버퍼에 젤 카세트를 흔들.
- 젤 카세트의 하단에 흰색 테이프를 제거 합니다.
- 일단 완벽 하 게 조립 및 탱크를 실행 하는 젤으로 젤 (최대 2 개의 카세트)를 삽입, 젤 긴장 쐐기 잠금.
- 채우기 위 (음극) 버퍼 챔버 실행 버퍼의 200 mL와 함께 우물 완전히 덮여 때까지. 어떤 누출 든 지 확인 하십시오.
- 항 산화의 500 µ L 추가 (참조 테이블의 자료에서 A14) 실행 버퍼를.
참고: 항 산화는 샘플 환 원제와 감소와 함께 사용 해야 하는 타당성 시 약 (참조 표 1) 전기 이동 법 동안 감소 상태를 유지 하 고 다시-트립토판 등 중요 한 아미노산의 산화를 방지 하 고 메티오닌입니다. - 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 차선 당 샘플의 50 µ g를 로드 합니다. 그런 다음, 분자 질량 표식으로 전 얼룩진된 단백질 표준 로드 (A18 테이블의 재료에 참조).
- 실행 버퍼의 600 mL로 낮은 (양극) 버퍼 챔버를 채우십시오.
- 175 V의 정 전압에서 ~ 60 분 젤을 실행 합니다. 실행의 끝에, 신중 하 게 젤 칼을 사용 하 여 카세트 판에서 젤을 제거 합니다.
-
조심 스럽게 상자를 얼룩 젤으로는 젤을 전송 합니다.
- 신선한 얼룩이 질, 제조업체의 지침에 따라 표 2에 설명 된 대로 하는 젤의 총 수에 따라 고정 솔루션을 준비 합니다.
- 락 플랫폼에 RT에서 10 분 동안 고정 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
-
담합 솔루션을 삭제 하 고는 젤 콜 로이드 블루 키트를 얼룩 얼룩.
- 준비 얼룩 솔루션 신선한 얼룩이 질 필요가 있는 젤의 총 수에 따라 표 3에 설명 된 대로 제조업체의 지시에 따라.
- 첫째, 적절 한 볼륨을 측정 하 고 직접 젤 얼룩 상자에에서 별표 (*)로 표시 된 구성 요소를 믹스. 락 플랫폼에 RT에서 10 분 동안 염색기 B 없이 얼룩 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
- 얼룩 상자 포함에 직접 염색기 B 추가 * 솔루션 얼룩. 염색기 B를 사용 하기 전에 잘 흔들어 있는지 확인 합니다.
주의: 7.10.1과 연기 후드 7.11.1 준비 단계를 실시 합니다.
- 최상의 전반적인 결과 위해 밤새 얼룩 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
참고: 얼룩진된 밴드 염색기 B. 얼룩의 추가 3 h의 최소 필요 하 고 얼룩 솔루션에 더 많은 시간에 대 한 경우 강도 다양 하지 않습니다 후 10 분 내에 표시 될 것입니다. - 신중 하 게 얼룩 솔루션을 가만히 따르다 하 고 이온된 물 200 mL를 바꿉니다. 흔들어 취소 배경 물에 적어도 7-8 h에 대 한 gel(s).
참고: 이온된 수는 더 나은 과도 한 얼룩을 제거 하는 destaining 절차 동안 여러 번 변경 되어야 합니다. gel(s) 수 있습니다 또한 남아 있을 물에서 최대 3 일 동안 단백질 밴드 강도 손상 시 키 지 않고. 경우는 gel(s) 다음 단계를 즉시 대상이 되지 않습니다, 그것은 장기 저장을 위한 4 ° C에서 20% 황산 용액에 저장할 수 있습니다.
8. 젤 Tryptic 소화
참고: 이 프로토콜 메서드에 솁첸코 외.17, 약간의 수정에 의해 따라 이다. 층 류에이 절차를 실시 한다 후드와 펫, 팁, 튜브, 유리의 전용된 세트를 사용 하 여이 목적을 위해 특별히. 착용 장갑 및 적절 한 실험실 복 각 질 및 다른 오염을 방지 하기 위해 모든 시간에. 모든 솔루션 및 곧 사용 하기 전에이 절차에 사용 된 시 약을 준비 합니다.
- 깨끗 하 고 새로운 톰 블레이드와 젤에서 단백질 밴드를 삭제할. 작은 조각 (약 1 m m x 1 m m 2 m m x 2 m m)으로 밴드를 잘라. 신중 하 게 1.5 mL microcentrifuge 튜브 젤 조각 전송 합니다.
참고: 너무 작은 조각 피 펫 팁을 방해할 수 있는 하 고 더 큰 펩 티 드 복구를 줄일 것입니다. 매우 날카로운 톰 블레이드를 사용 하 여 때 주의 합니다. -
Destaining
- 100 mM ABC 솔루션 / = (1:1, v/v)를 포함 하는 destaining 솔루션의 500 μ를 추가 하 고 가끔 흔들어 또는 vortexing 30 분 RT에서 샘플을 품 어.
- Destaining 솔루션을 신중 하 게 플라스틱. 잔여 얼룩과 어떤 튜브를 시각적으로 확인 합니다. 젤 조각 여전히 파란색 얼룩이 진 경우 8.2.1 단계를 반복 합니다.
-
감소 및 알
- 갓된 DTT 솔루션의 ~ 400 µ L을 추가 하 고 솔루션 완전히 젤 조각 커버 해야 30 분 56 ° C에서 품 어. 신중 하 게 줄이는 솔루션 플라스틱 하 고 삭제.
- 갓된 IAA 솔루션의 ~ 400 µ L을 추가 하 고 30 분 제거는 피 펫으로 버퍼는 alkylating 및 삭제에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어.
-
소화
- 깔끔한 ACN의 500 µ L RT에 대 한 추가 10-15 분 젤 조각 축소 하 고 불투명 하 게 될 때까지. ACN 개 pipette 고 젤 조각 후드 5-10 분에 대 한 건조.
- 완전히 커버 젤 조각에 각 관으로 트립 신 솔루션의 50 µ L 플라스틱. 30 분 동안 4 ° C에 튜브를 품 어.
- 30 분 후 모든 트립 신 솔루션 젤 조각에 의해 흡수 되어 각 튜브를 선택 합니다. 필요한 경우 완전히 커버 젤 조각에 충분 한 양의 trypsin 버퍼 (50-100 µ L, 튜브에서 볼륨에 따라)를 추가 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 샘플을 품 어
-
펩타이드 추출
- 조심 스럽게 플라스틱 튜브 및 청소 microtubes 전송에서 추출 된 펩타이드 솔루션. 원심 진공 증발 기에 상쾌한 드라이.
참고: 남은 젤 조각을 버리지 마십시오. - 추출 버퍼의 100 µ L를 추가 (단계 1.7 참조) 각 관을 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
- 각 밴드에 따라 추출 된 펩 티 드를 포함 하는 동일한 microtubes에는 상쾌한 플라스틱 고 진공 원심 분리기에서 아래로 건조.
참고: 즉시 사용 하지, 말린된 펩타이드 추출 물 추가 사용까지 몇 개월-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 조심 스럽게 플라스틱 튜브 및 청소 microtubes 전송에서 추출 된 펩타이드 솔루션. 원심 진공 증발 기에 상쾌한 드라이.
9. 펩타이드 정화
참고: 이 펩 티 드 샘플 담 고 정화 절차 C18 피 펫 팁의 사용 실시 (C15 테이블의 재료에 참조). 각 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.
- 준비 원뿔 원심 분리기 튜브에 약 수 다음 솔루션 신선한 2 mL microcentrifuge 튜브로 펩 티 드 정화 절차에 대 한 표 4와 같이. 펩 티 드 정화에 대 한 튜브의 개요는 다음과 같습니다: (샘플 솔루션), 튜브 튜브 B (일로 솔루션), 튜브 C (평형 솔루션), 튜브 D (세척 솔루션), 튜브 F (는 빈 2 mL 또는 5 mL microcentrifuge 튜브에 따라 튜브 E (차입 솔루션) 청소, 폐기물 처리에 대 한 샘플의 수), 및 튜브 G (깨끗 하 고 빈 microtube, 용량 0.2 mL).
- 단계 8.6.3 0.1%의 10 µ L에서에서 말린된 펩타이드 추출 reconstitute TFA. 이 튜브는 튜브 A. 지정
- 5 분 동안 얼음 초음파 목욕에서 튜브 A sonicate
- 1 분에 1000 x g 벤치탑 원심 분리기에서 샘플 솔루션 아래로 회전 합니다.
- P10 micropipette 10 µ L의 최대 볼륨 설정으로 설정 하 고 C18 피 펫 팁을 단단히 부착.
- 일로 솔루션 (B 관)으로 피 펫 팁을 담가 그리고 신중 하 게 포장 소재에 발음. 천천히 분배 튜브 F. 반복으로 폐기물이이 단계 적어도 7-8 시간.
참고: 죽은 중지 피 펫 플런저를 우울 하 게 천천히 해제 또는 절차에 걸쳐 플런저를 분배. 주의 사항 C18 열에 최대 펩타이드 바인딩 되도록 pipetting 동안 팁으로 공기 방울을 소개를 하지. - 펩 티 드 바인딩 위한 팁 발음 10 equilibrate 튜브 C. µ L 평형 솔루션 솔루션을 삭제 하 고이 절차를 반복 3-4 회.
- 다음, 발음 하 고 열 팁을 펩 티 드를 바인딩할 여러 번 (두께 따라 해당 젤 밴드) 관 A에서에서 샘플 솔루션을 분배 합니다.
주의: 포부와 바인딩 절차 (단계 9.8) 동안 분배 단계 관 A. 내의 실시 샘플 솔루션을 낭비를 분배 하지 않습니다. - 튜브 d에서 세척 솔루션을 발음 하 고 낭비 (튜브 F) 4 ~ 5 배 그것을 삭제 하 여 C18 피 펫 팁을 세척.
- 마지막으로, pipetting 차입 솔루션 (튜브 E) 하 고는 eluant 관 g.로 분배 하 여 바인딩된 펩 티 드를 elute
- 샘플 샘플 복구 증가 당 2 ~ 3 사이클 전체 단계를 반복 합니다.
- 하나의 샘플 정화 후 끝을 삭제 하 고 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 하 여.
- 드라이 진공 집중 장치에 순화 된 펩 티 드 있다.
참고: 순화 샘플 LC ESI LTQ Orbitrap MS 시스템에서 LC-MS/MS 분석에 대 한 준비가 있다. 추가 사용까지-20 ° C에서 말린된 견본을 저장 합니다.
10. 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화-MS/MS 분석
참고: 레이블 없는 양적 proteomics 분석 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 선형 이온 함정-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS 시스템에서 수행 됩니다. LC는 Rheos Allegro 제 사기 펌프 (HTS PAL autosampler 결합 그리고 시스템 구성 30 m m x 0.5 m m C18 사전 열 150 m m x 0.5 m m C18 열에 연결 온라인 degasser를 장착의 구성 합니다. 사용 단계 수성 용 매 A 역방향 0.1% (v/v) 포 름 산 및 유기 용 매 B LC MS 학년 이기 0.1% (v/v) 포 름 산으로 구성 된 LC MS 학년 물으로 구성 된. 젤 밴드 당 60 분의 상영 시간으로 그라디언트를 사용 하 여 우리의 이전 연구6,16에서 자세히 설명 된 대로.
- 0.1%의 10 µ L에서 순화 된 펩 티 드 샘플을 분해 TFA. 5 분 동안 얼음에 샘플 sonicate
- V-하단 96 잘 접시에 10 µ L 샘플을 플라스틱을 명확 하 고, 접착 커버 필름으로 봉인.
- 접시는 autosampler 전송.
- 60 분: 0의 각 실행 시간에 대 한 다음 그라디언트를 사용 하 여-35 분 (15-40% 용 매 B), 35-40 분 (40-60% 용 매 B), 40-45 분 (60-90% 용 매 B), 45-50 분 (90% 용 매 B), 50-53 분 (90-10% 용 매 B), 그리고 53-60 분 (10% 용 매 B).
- 사용 하는 악기의 대량 spectrometric 다음과: 긍정적인 이온 분무 이온화 모드, 스프레이 전압 (2.15 kV), 모 세관 온도 (220 ° C), 종속 데이터 수집 모드, 자동 수집 Orbitrap MS 사이 전환 하 고 LTQ MS/MS, orbitrap 해상도 (30000), m/z 범위 (1600을 300), 대상 자동 이득 제어 (AGC, 1.0 x 106 이온), 내부 재 (polydimethlycyclosiloxane [PCM] 실시간으로 m/z 445.120025 이온에), MS 모드에서 사용 하는 대량 옵션을 잠금 상위 5 개 가장 강렬한 선구자 이온, 추가 조각화 충돌 유도 된 분리 (CID)에 의해 정규화 충돌 에너지 (후부 터, 3의 반복 횟수와 30 ms의 활성화 시간 35%), 및 동적 제외 기간을 선택 하 여 가져온 연동 데이터 (600 s).
참고: 결과 조각난된 이온 LTQ는에 기록 됩니다. - 각 샘플에 대 한 적어도 3 개의 생물 복제를 실행 합니다.
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Representative Results
제한 된 샘플 가용성 안과 연구에 주요 단점 중 하나입니다. 대응 하 게, 최적의 단백질에 대 한 추출 방법 같은 안구 혈관은 종종 논란의 여지가 적은 양의 샘플에서 얻을. 날짜 하려면, 특히 retrobulbar 혈관에서 단백질 추출에 대 한 음식을 장만 하는 방법의 부족이입니다. 방법 최적화의 첫 번째 단계와의 증거-원칙 일반적으로 효능과 몇몇의 견고성을 비교 하는 상대적으로 새로운 시 약, T 단백질 추출 세제를 고용 하는 따라서-당, 우리 심장 조직을 사용 하 여 파일럿 연구 실시 쥐 (때문에 간단 하 고 충분 한 샘플 가용성 최적화 단계). 우리는 총 단백질 농도 다음과 같은 시 약을 사용 하 여 식별 하는 총 단백질 비교 하 여 단백질 수익률 비교: T-당 0.02 %n-라우릴-β-D-maltoside (DDM), 1 %3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-프로 판 된 (챕) 1 %amidosulfobetaine-14 (ASB-14)와 ACN TFA의 혼합물 (20% = 뉴스 / 1 %TFA). 이러한 세제의 각 추출 견본에서 단백질의 총 금액은 에서처럼 그림 6A, T 추출 하는 조직에서 가장 높은 수익률-DDM (22.88 µ g/mg 조직), 챕 이어서 (56.4 µ g/mg 조직), 당 (16.01 µ g/mg 조직), ASB-14 (11.56 µ g/mg 조직)와 ACN/TFA (4.38 µ g/mg 조직)에서 최저 수익률. 일관 되 게, 총 단백질 발견 했다 또한 T 당 추출 샘플 (1649 단백질)에서 가장 높은 > DDM (1310 단백질) > 균열 (1319 단백질) > ASB-14 (1121 단백질) > = / TFA (924 단백질), 표시 된 그림 6B. 이러한 결과 바탕으로, 우리는 t sPCA 샘플에서 단백질 추출 진행-당.
다음, 1DE 사전 분류 이전 샘플 준비 프로토콜의 최적화는 잘 분리 된 단백질 밴드와 샘플 및 복제 사이의 높은 재현성 결과 얻기 위해 매우 중요 한 단계 이다. 이 단계의 중요성 반영 이며 1DE의 결과에 강조. 그림 7 보여준다 sPCA의 1DE 단백질 프로 파일의 비교 전과 후 최적화 된 샘플 준비에 복종 하 고 단계를 청소. 전반적으로, 높은 수준의 단백질 밴드의 번짐 및 가난한 분리 차선 3에 관찰 되었다. 이 프로필 샘플 추출 시 약 및 지질과 세포 파편 등 오염 물질이 포함 될 수 있습니다 보여 줍니다. 그러나, sPCA 샘플을 상쾌한으로 분리 된 펠 렛 고은 최적화를 대상이 프로토콜 결과 모범적인 1DE 프로필 레인 1와 2 (그림 7)에 표시.
이러한 결과, 약속에 따라 gist에 눈 microvessels에서 급속 한, 강력 하 고 효율적인 수용 성 단백질 추출에 대 한 최적화 된 방법 조직 단백질 추출 시 채용 (T-당) 추출 버퍼 2A를 사용 하 여 (TM-PEK)를 추출 멤브레인 기반 단백질 샘플 펠 릿에서 발견. 그 후, 샘플 homogenates (T-분수 당) 버퍼 교환 및 샘플 3 kDa 원심 필터 단위 1DE 전에 청소를 받게 됩니다. 최적의 샘플 농도 잘 당 50 µ g 이다. 다른 한편으로, 그것은 여기이 프로토콜만 혈관 같은 작은 조직에 대 한 적용 되지 않습니다 하지만 다른 조직 기반 샘플에 대 한 적합도 강조 표시 됩니다. 이것은 1DE 프로필 murine 두뇌와 심장 조직, 상쾌한 (그림 8A, B)와 펠 릿 분수 (그림 8C, D에서 추출 수 있는 단백질의 많은 수는 증명에 의해 입증 ).
그림 1 : 워크플로 개요. 돼지 sPCA의 레이블 없는 양적 프로테옴 분석에 대 한 고용 하는 프로토콜의 도식 적인 표현입니다. 일반적으로이 절차는 microvessel 샘플 준비 단계 및 MS 기반 proteomics 접근 하는 두 개의 주요 섹션으로 나누어져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 돼지 눈의 대표 사진. (A) 측면 볼 눈 글로브 쇼의 각 막, 눈, sclera, 주변 근육 및 시 신경의 앞쪽 부분에 있는. (B) 후부 보기는 눈의 시 신경. SPCA 눈 글로브 뒤 본의 (C) 지점 paraoptic 및 말 초 분 지로 이루어져 있습니다. (D) 지방과 결합 조직 포위와 고립 된 sPCA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 샘플 균질. 대표 균질 후 보여주는 전에 샘플 (A)와 (B) 사진을. (C)는 무 균된 샘플 더 상쾌한 포함 하는 수용 성 단백질과 불용 성, 기반 막 횡단 단백질을 포함 하는 펠 릿으로 분리 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 작은 단백질 추출 절차. 단백질 변성을 방지 하기 위하여 펠 릿 샘플은 얼음에 추출 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 샘플 청소. 버퍼 교환 3 kDa 컷오프 원심 필터 MS 분석 전에 샘플을 청소를 함께 수행 됩니다. 대표 여과 후 보여주는 전에 homogenate (A)와 (B) 사진을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 단백질 추출 효능 및 견고성 T 사이 비교-당 및 4 개의 일반적인 단백질 추출 세제. (A) 단백질 금액 및 (B) T를 사용 하 여 식별 하는 단백질의 총 수를 묘사 하는 가로 막대형 차트-당 0.02 %DDM, 챕 스 1%, 1% ASB 14 그리고 20% = 뉴스 / 1 %TFA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 돼지 sPCA 단백질 프로 파일의 최적화 전후 대표 1DE 젤. 레인 3 묘사 하지 사전 세척 단계 높였을 샘플의 1DE 프로필. 레인 1과 2 최적화 된 샘플 준비 샘플 쓰는 단계 청소 후 표면에 뜨는 sPCA와 펠 릿, 모범적인 단백질 프로필 각각 표시 합니다. 젤은 콜 로이드 블루 키트 얼룩으로 얼룩이 진다. M = 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 모범적인 조직 기반 샘플의 대표 콜 로이드 블루 스테인드 1DE 젤. 상쾌한 (A, B) 및 펠 릿 (C, D) murine 두뇌와 심장 조직의 단백질 단면도, 각각, 잘 당 50 µ g에 샘플링 합니다. 상쾌한 및 펠 릿 단백질 T 고용 추출한-당 고 막 횡단 단백질 추출 키트, 각각. M = 마커. R1-r 3는 3 개의 복제를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 볼륨 (µ L) |
| 샘플 (상쾌한 또는 펠 릿) | x |
| LDS 샘플 버퍼 (4 배속) | 2.5 |
| 환 원제 (10 배) | 1 |
| 이온된 수 | 최대 6.5 (에 따라 샘플 볼륨) |
| 샘플 당 총 볼륨 | 10 |
| 참고: x는 단백질 농도 (50 µ g 총 단백질 샘플 당) 기준으로 계산. | |
표 1: 1 차원 젤 전기 이동 법 (1DE). 샘플 준비 1DE 수행에 필요한 구성 요소 세부 사항.
| 솔루션 | 1 젤 (mL) | 2 젤 (mL)에 대 한 | 4 젤 (mL)에 대 한 |
| 이온된 수 | 40 | 80 | 160 |
| 메탄올 | 50 | 100 | 200 |
| 초 산 | 10 | 20 | 40 |
표 2: 젤 고정. 1DE에 대 한 해결 솔루션을 준비 하는 데 필요한 부품의 세부 사항.
| 솔루션 | 1 젤 (mL) | 2 젤 (mL)에 대 한 | 4 젤 (mL)에 대 한 |
| * 이온된 수 | 55 | 110 | 220 |
| * 메탄올 | 20 | 40 | 80 |
| * 염색기 A | 20 | 40 | 80 |
| 염색기 B | 5 | 10 | 20 |
표 3: 젤 얼룩. 콜 로이드 블루 솔루션 얼룩의 준비에 대 한 구성 요소의 세부 사항.
| (대 한) 솔루션 | 구성 | = * * | H2O * * | TFA | 총 볼륨 * |
| 일로 | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing 및 평형 | 0.1% TFA | 10 mL | 10 Μ L | ~ 10 mL | |
| 펩 티 드 차입 | 0.1 %TFA = = 뉴스: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 Μ L | ~ 10 mL |
| 참고: * 총 볼륨 청소 팁 우편을 복종 될 샘플의 총 수에 따라 조정 되어야 한다. | |||||
| * *를 사용 하 여 HPLC 급 또는 LC-MS-학년. | |||||
| # 준비 2 개의 별도 Eppendorf 관 세척 및 평형, 각각. | |||||
표 4: 펩 티 드 정화. 구성 요소와 C18 피 펫 팁을 사용 하 여 펩 티 드 정화 절차에 대 한 그들의 각각 작곡의 세부 사항.
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Discussion
다양 한 안구 샘플의 프로 파일링 종합 프로테옴 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 연루를 명료 하 게 하는 중요 하 고 필수적인 첫 번째 단계입니다. 위의 샘플 준비 단계는 강조 표시 된 검토에 의해만 달 호텔 외. 심도 있는 논의로 중요 한 고품질 데이터를 얻을 하 고 이러한 분석에서 얻은 결과의 재현성을 보장, 샘플 처리 절차 눈의 다른 부분에 대 한 2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 전략1을 채용합니다. 이러한 조사의 라인, 우리의 현재 연구 준비를 위한 급속 한, 강력 하 고 매우 효율적인 MS 호환 샘플 모델 눈 microvessels로 돼지 sPCA를 사용 하 여 최적화 된 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 이 조사는 고품질 MS 데이터를 생성 하기 위해 수량 제한 동맥 샘플에서 충분 한 양의 단백질을 추출 하는 특정 방법론의 부족에 따라 시작 되었다. 우리의 방법은 우수한 프로테옴 매핑18수 있도록 마이크로 스케일 기술의 사용에 대 한 지식 기존 본문에 기여 하는 노력 이기도 합니다.
양적 프로테옴 분석에 대 한 최적의 성능을 위해 고려 될 필요가 있는이 실험 프로토콜에 몇 가지 중요 한 측면이 있습니다. 첫째, 샘플은 금액에 관계 없이 최적의 단백질 추출 되도록 완전 한 균질을 복종 된다 중요 하다. 우리의 방법론에서 서로 다른 크기의 구슬 및 총알 믹서 균질 화기의 혼합물의 사용 완전 한 조직 세포에 대 한 수단이 됐다. 종류와 사용 하는 구슬의 크기는 샘플 종류와 금액에 따라 달라 집니다. 현재 사용 ZrO2 등 스테인리스, 높은 밀도와 구슬 중간 힘든 조직에 적합 하 고 특히 혈관 근무.
둘째,는 상쾌한 펠 릿에서 분리 하 고, 소화 및 지정 된 키트를 사용 하 여 추출 하는 후자을 필수적 이다. 이 단계는 온화한 세제19,20,21을 사용 하 여 균질 수 없는 막 횡단 단백질 같은 고분자 중량 단백질을 추출. 침전 된 펠 릿은 최고의 쥡니다를 사용 하 여 시작-최대 활기찬 동요 중에 도입 또는 메서드를 떨고에 의해 발생 하는 샘플 손실을 방지 하기 위해 녹 았다.
셋째, 방법론에 명시 되지 않는 한 모든 샘플 준비 절차 (4 ° C) 낮은 온도에서 실시 됩니다 주목할 만한입니다. 이 추출 절차 동안 최소한의 단백질 변성입니다. 넷째, 반복 동결-해 동 샘플의 단백질 저하 및 샘플 품질의 저하를 방지 하기 위해 피해 야 한다.
마지막으로, 오염 물질 및 세제의 제거는 단백질 추출 중에 젤 분별 법, 효소 소화 및 MS 분석18,22다운스트림 간섭 방지 하기 위해 필요한. 이러한 오염 물질 전기 이동 별거의 해결책으로 종종 방해 1DE 프로필 (그림 7)에서 같이 대응 하 게, 결과의 시각화를 좌우 하 고. 이 문제를 회피, 원심 컷오프 필터 장치를 사용 하 여 그들의 사용의 용이성과 최소한의 단백질 손실에 대 한 선호 됩니다.
현재 실험 절차 최적의 레이블 없는 양적 MS 분석에 대 한 중요 한 샘플 준비 단계에 깊이 있는 outlook 제공, 하지만 두 가지 제한이 있습니다. 첫째, sPCA 샘플 후속 분석을 위해 충분 한 양의 조직 제공 하기 위해 두 돼지 눈에서 풀링된 했다. 로컬 도살 장에서 취득 하는 눈은 무작위 이기 때문에 따라서, 그것은 알 수 없습니다 혈관 같은 동물의 눈에서 고립 되는 경우, 샘플 풀링 간 개별 유사5,6을 완화할 수 있습니다. 그러나, 현재 방법론 또한 사용할 수 있는 샘플의 양에 따라 개별 샘플 준비에 대 한 적응 수 있습니다. 둘째, 제시 하는 방법론은 특별히 개발 되었습니다 1DE 젤 기반 분류. 내려와 다른 분류 방법 통합에 대 한 현재 메서드의 호환성 보증 조사, 비록 우리가 좋은 재현성, 더 깊이 분석의 품질 관리의 용이성에서에서 배열 하는 여러 가지 요인으로 인하여 1DE 하기로 했다 특히 현재 exemplified 안구 혈관1,,523등 복잡 한 샘플에 대 한.
결론적으로, 위의 강조 하는 한계에도 불구 하 고 설명한 워크플로 엄격한 샘플 준비 단계 작은 양의 혈관의 분석을 위해 특별히 음식을 장만 하는 간단 하지만 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 또한이 방법을 쉽게 다른 세포 및 조직 기반 샘플의 질량 분석 기반 proteomic 분석을 위해 통합 될 수 있다 여기에서 강조 하는 것이 중요.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
박사 Manicam 내부 대학 연구 자금 (Stufe 1) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠와 도이치 가운데 (석사 8006/1-1)에서 부여의 대학 의료 센터에서 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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