Summary
Proteom karakteristikk av okulære mikrovaskulær senger er avgjørende for grundig forståelse av mange okulær patologi hos mennesker. Denne studien viser en effektiv, rask og robust metode for protein utvinning og prøve forberedelse fra små blodkar ansette svin kort bakre ciliary arteriene som modell fartøy for masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyser.
Abstract
Bruk av isolerte okulær blodkar i vitro å dechiffrere patofysiologiske delstaten øyet ved hjelp av avanserte teknologiske tilnærminger er betydelig utvidet vår forståelse av visse sykdommer. Massespektrometri (MS)-basert Proteomikk har dukket opp som et kraftig verktøy for å løse endringer i molekylære mekanismer og signalnettverk trasé i vaskulær senger i helse og sykdom protein. Eksempel forberedelsene før MS analyser er imidlertid avgjørende reproduserbar resultater og grundig forklaring av den komplekse proteom. Dette er spesielt viktig for utarbeidelse av okulære microvessels, der eksemplar tilgjengelig for analyser er ofte begrenset og dermed utgjør en utfordring for optimal protein utvinning. Denne artikkelen forsøker å gi en effektiv, rask og robust protokoll for eksempel forberedelse fra en eksemplarisk retrobulbar okulær vaskulær seng ansette svin kort bakre ciliary arteriene. De nåværende metoden fokuserer på protein utvinning prosedyrer fra både nedbryting og pellet på utvalget etter homogenisering prøve rengjøring med sentrifugal filter enheter før endimensjonal gel gelelektroforese og peptid rensing trinn for etikett-fri kvantifisering i en væske kromatografi-electrospray ionization-lineær ion felle-Orbitrap MS system. Selv om denne metoden har blitt utviklet spesifikt for Proteomikk analyser av okulære microvessels, har vi også gitt overbevisende bevis at det kan også lett brukes for andre vev-basert prøver.
Introduction
Fremme innen Proteomikk, integrert og uovertruffen data samling makt som tillater, revolusjonert sterkt vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende visse sykdom forhold så vel som reflekterer den fysiologisk tilstand hos en bestemt celle befolkningen eller vev1,2,3,4. Proteomikk har også vist seg for å være en viktig plattform i ophthalmica forskning følsomhet og objektiv analyse av forskjellige okulær prøver som lettere identifikasjon av potensielle sykdom markører for eventuell diagnose og prognose, som dokumentert elegant av mange studier de siste årene, inkludert noen av oss1,5,6,7,8,9,10. Men er det ofte vanskelig å få menneskelige prøver for proteomic analyser av etiske grunner, spesielt med tanke på behovet for kontroll materiale fra friske individer for pålitelig sammenlignende analyser. På den annen side, er det også vanskelig å skaffe tilstrekkelig mengde prøver for optimal og pålitelig masse spectrometric analyser. Dette er spesielt viktig for masse-begrenset biologiske materialer som mikro-blodkar i øyet. En slik stor retrobulbar blod fartøy som spiller viktige roller i regulering av okulære blodstrøm er kort bakre ciliary arterien (sPCA). Forstyrrelsene eventuelle uregelmessigheter i denne vaskulær seng kan resultere i alvorlig klinisk konsekvenser, som kan føre til patogenesen av flere sight-truende sykdommer som grønn stær og nonarteritic fremre iskemiske fiberoptisk nevropati (NAION)11 , 12. men det er en mangel på studier Klargjørende proteom endringene i denne arteriell sengen på grunn av ovennevnte ulempene. Derfor de siste årene, hus svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har dukket opp som en god dyremodell ophthalmica forskning på grunn av høy morfologiske og Fylogenetiske likhetene mellom mennesker og griser13, 14,15. Svin okulær prøvene er lett tilgjengelig og viktigst er mer nøyaktig gjengivelse av menneskelig vev.
Vurderer den viktige rollen blodkar i øyet, samt mangel på metodikk hensyn til effektiv protein utvinning og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere preget proteom av svin sPCA med en protokoll som resulterte i identifikasjon av mange proteiner16. Basert på denne studien, har vi ytterligere optimalisert og beskrev grundig vår metode i denne artikkelen, som lar proteom analyse fra minutt mengder prøver ved svin sPCA som modell vev. Selv om Hovedformålet med denne studien var å etablere en MS-kompatibel metode for masse-begrenset okulær blodårene, har vi gitt betydelige eksperimentelle bevis at beskrevet arbeidsflyten kan også være bredt brukt til forskjellige vev-basert prøver.
Det er tenkt at denne arbeidsflyten vil være instrumentell for utarbeidelse av høy kvalitet MS-kompatible prøver fra små mengder materialer for omfattende proteomanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer dyr utvalg ble utført i streng overholdelse av foreningen for i visjon og Oftalmologi (ARVO) erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og institusjonelle retningslinjer. Denne studien ble utført og godkjent på Institutt for Oftalmologi, Universitetet medisinske sentrum Mainz.
Merk: Svin øyne synsnerven og extraocular vev anskaffet frisk fra den lokale abattoir umiddelbart evaluering. Enucleated øyne ble transportert til laboratoriet i iskalde fosfat bufret saltvann (PBS) og brukes umiddelbart. Skjematisk oversikt over arbeidsflyten ansatt er avbildet i figur 1.
1. løsninger
- For å forberede Krebs-Henseleit (K-H) buffer, veier de følgende kjemikaliene (27.68 g NaCl, 8.4 g NaHCO3, 1,4 g KCl, 1,18 g MgSO4og 0,64 g KH2PO4) i en tørr og ren 50 mL konisk sentrifuge tube og , 1,47 g CaCl2 og 8.0 g av glukose i en annen rør.
Merk: Pulver blanding av disse kjemikaliene bør lagres på et tørt og kjølig sted. CaCl2 og glukose pulver blanding er best tilberedt ferske å hindre absorpsjon av fuktighet og klumper. - For å forberede 200 µL av utvinning buffer 2A per pellet prøve, mix 100 µL av utvinning buffer 2 og 100 µL til reagensen A fra transmembrane protein utvinning kit (se B6 i Tabellen for materiale).
Merk: Aliquot komponenter i transmembrane protein utvinning kit bestående av utvinning buffer 2 og reagens A protease hemmer cocktail arbeider deler og butikk på 20 ° C for langvarig bruk. Unngå gjentatt frysing og tining. Tine reagenser til romtemperatur (RT) før starten av pellets utvinning prosedyren. - For å forberede ammonium bikarbonat (ABC, 100 mM) løsning, løses 0.39 g av ABC i 50 mL deionisert vann.
- For å forberede 10 mM løses 1, 4-dithiothreitol (DTT) løsning, 30 mg DTT i 20 mL 100 mM ABC.
- For å forberede 55 mM Iodoacetamide (IAA) løsning, løses 200 mg IAA i 20 mL 100 mM ABC.
Merk: IAA holdes i mørket. Bruk en aluminiumsfolie brytes rør med lys-sensitive løsninger. - Forberede trypsin buffer inneholder 10 mM ABC og 10% (vol / vol) acetonitrile (ACN). Legge til 1,5 mL trypsin bufferen i en flaske av 20 µg av trypsin å oppløse innholdet å forberede en 13 ng/µL trypsin fungerende løsning.
Merk: Sekvensering karakter endret trypsin leveres lyofiliserte og lagres i 20 ° C før bruk. - For å forberede peptid utvinning buffer, bland 1:2 (v/v) på 5% maursyre med ACN.
Merk: Forberede alle løsninger i trinn 1.3-1.7 frisk like før bruk og kast eventuelle ubrukte volum. - For å forberede 0,1% trifluoroacetic acid (TFA), bland 10 µL av TFA med 10 mL deionisert vann.
2. isolering av kort bakre Ciliary arterier
Merk: Svin øyet er i utgangspunktet delt inn i fremre (figur 2A) og bakre deler (figur 2B).
- Sett øyet verden i en disseksjon kammer som inneholder iskald K-H-bufferen. Nøye klippe bort omkringliggende muskler og vev med en skarp Mayo saks.
- Gjøre et snitt med en skalpell og kuttet i verden langs ekvator flyet med en skarp Mayo saks før øyet er atskilt i de fremre og bakre halvdelene. Fjerne så mye glasslegemet som mulig fra den bakre delen av øyet med en standard mønster tang.
Merk: Separasjon av øyet verden i to halvdeler forenkler isolering av sPCA med letthet uten en bevegelig øye i disseksjon parabolen. Men er dette trinnet ikke obligatorisk. Fartøyene kan også være isolert uten å åpne øyet verden. - Bruke disseksjon pinner å nøye pin ned den bakre delen av øyet med netthinnen siden ned og synsnerven vender mot eksperimentator.
- Forsiktig klippe bort bindevev omgir den optiske nerven å eksponere den underliggende retrobulbar blodkar med en Student Vannas våren saks.
- SPCA sees korte grener av fartøy (mellom 5-8 grener) som trenge sclera og circumferentially surround synsnerven hodet (figur 2C). Isolere paraoptic og distale sPCA med omkringliggende bindevev med en type 5 presisjon pinsett og Vannas capsulotomy saks (figur 2D).
Merk: Påse at K-H bufferen iskald gjennom isolasjon prosedyren. Det anbefales å endre bufferen hver 20-30 minutter, avhengig av omgivelsestemperaturen.
3. eksempel forberedelse
- Forsiktig fjerne bindevev fra arteriell segmentene ved hjelp av ekstra tynn type 5 presisjon pinsett og Vannas capsulotomy saks under en stereomicroscope og skyll isolert arteries i iskalde PBS å fjerne forurensninger og blod rester.
Merk: Hvis utvalgene ikke er utsettes til de neste trinnene umiddelbart, snapin-fryse dem i flytende nitrogen og store i-80 ° C til fremme bruk. - Bassenget fra to øyne å få en biologisk kopiere, overføre dem til 1,5 mL microcentrifuge rør, og veie eksemplene bruker en analytical balanse.
- Legg en blanding av 0,5 mm og 1.0 mm zirkonium oksid perler, etterfulgt av vev protein utvinning reagens til hver tube (T-PER; se B7 i Tabellen for materiale).
Merk: Volumet av T-PER er avhengig av vekten av prøvene i hver retning, med forholdet 1 mL av reagens til 50 mg av prøven. Regel av tommelen til å følge når du legger rør for homogenisering er Volumforholdet 1:1:2 = eksempel: perler: T-PER (Figur 3A). Ikke bruk for stort et volum på utvinning bufferen og for lite mer perler for å hindre ineffektiv homogenisering. - Laste inn prøven rør i en blender homogenizer (se D6 i Tabellen for materiale). Angi timer 2 min og hastighet nivå 6 og starte homogenisering. Etter kjøringen av prøvene for komplett homogenisering og gjenta syklus til prøvene er helt homogenisert (Figur 3B).
Merk: Totalt 24 eksempel rør kan være homogenisert i ett Kjør. Det er viktig å holde prøvene kaldt under homogenisering prosedyren å minimere protein rødsprit. Bullet blender homogenizer brukt i denne studien har en iboende kjøling funksjon som holder prøvene kaldt. I tilfeller der ingen interne kjøling funksjonen er tilgjengelig i homogenizer kan prøver holdes på isen i mellom hver kjøre. - Pipetter forsiktig homogenate i frisk microcentrifuge rør. Sentrifuge eksempler på 10.000 x g for 20 min på 4 ° C pellets uløselig proteiner og separat nedbryting inneholder løselig proteiner. Nøye Pipetter ut nedbryting i frisk microcentrifuge rør uten berørende pellets laget (Figur 3C).
Merk: Både nedbryting og pellets kan lagres i-80 ° C til fremme bruk.
4. pellet fordøyelse
- Legge til 200 µL av utvinning buffer 2A og 5 µL av protease hemmer cocktail hver pellet prøve. Utsette pellets flere ganger med en pipette.
Merk: Bland utvinning reagensene godt før du legger til pellet. Holde utvinning buffer 2A på is og den protease inhibitor på RT hele utvinning prosedyren. -
Bruk en ultralyd homogenizer til helt homogenize pellet.
- Angi amplituden til 60 og syklus til 1. Bruk en sonde laget av Titan (Ø 0,5 mm, 80 mm lang), som passer for homogenisering av prøver med små volumer (10-500 µL).
- Fordype sonden i pellets og utvinning buffer blandingen og trykk start for å utsette prøve å ultrasoniske bølger.
- Sonicate prøven før pellet klumper er helt homogenisert. Pause i noen sekunder mellom hver sonication.
- Sjekk for komplett homogenisering visuelt. Bland i homogenate flere ganger med en pipette for å sikre at det ikke er noen klumper.
Merk: Pellet utvinning prosedyren skal utføres på is å hindre protein rødsprit på grunn av varmen som genereres i løpet homogenisering (Figur 4).
5. prøve rengjøring og Buffer Exchange
- Bruke sentrifugal filter enheter med 3 kDa cutoff (se D3 i Tabellen for materiale) for denne prosedyren i henhold til produsentens instruksjoner med modifikasjoner der det er aktuelt. Først setter du inn filter enheten inn i et microcentrifuge rør (forutsatt i filteret pack).
- Pipetter 200 µL av eksempel homogenate til ett filter enhet og Legg 200 µL deionisert vann i samme filter. Cap det sikkert (figur 5et).
- Plass filteret enheten i en sentrifuge og spinn for 14.000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Fjerne enheten fra sentrifuge og separat filter enheten som inneholder eksempel konsentrat fra microcentrifuge røret som inneholder filtratet. Kast filtratet (figur 5B).
- Rekonstituer konsentrat ved å legge til 400 µL deionisert vann i filter enheten. Gjenta 5.3 og 5.4 tre ganger. Nøye Pipetter 'renset' eksempel konsentrat til en ren microtube.
Merk: Vanligvis et 200 µL råolje utvalg vil gi ~ 50-70 µL konsentrere etter filtrering. - Gjenta trinn 5.1-5.5 for de gjenværende prøve homogenates.
6. protein måling
- Bruke bicinchoninic syre (BCA) protein analysen kit (se B5 i Tabellen for materiale) for å bestemme protein konsentrasjoner av nedbryting og pellets fraksjoner sPCA prøvene på en plate-leser.
- Forberede albumin standard (BSA) fortynninger (siste BSA konsentrasjonene varierer mellom 25 til 2000 µg/mL) fra en 1 mL ampullen bestående av 2 mg/mL BSA, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Pipetter 10 µL av hver BSA standard fortynning og prøve replikerer (nedbryting og pellets) i hver brønn av en 96-brønns flat bunn microplate.
- Forberede BCA arbeider reagens ved å legge til 50 deler av BCA reagens A 1 del av BCA reagens B.
Merk: Beregne det totale volumet av arbeider reagensen kreves for hver måling før tilberedning og ferske Forbered tilstrekkelig volum basert på antall prøver og standard fortynninger å være assayed. - Nøye Pipetter 200 µL av BCA arbeider reagens i hver brønn. Dekker av microplate og ruge på 37 ° C i 30 min. Etter avkjøling platen til RT måle absorbans ved 562 nm på en plate leser (se D13 i Tabellen for materiale).
- Basert på standardkurven genereres for hver BSA standard konsentrasjon (µg/mL), bestemme protein konsentrasjonen av prøvene.
7. endimensjonal Gel geleelektroforese (1DE)
- Forberede prøvene 1DE som vist i tabell 1 (for ett eksempel). Bland eksempel blandingen godt med en pipette. Varme prøvene ved 70 ° C i 15 min og kult å RT.
- Forberede 1 x kjører Buffer ved å legge til 50 mL av MES SDS kjører Buffer 950 mL vaskebuffer vann. Bland godt.
-
Forberede precast 4-12% Bis-Tris protein gels (se B4 i tabellen av materialet).
- Klipp opp plast posen for å fjerne gel kassetten og skyll kassetten med deionisert vann.
- Fjern kammen av gel kassetten i en flytende bevegelse, ta vare ikke for å skade brønnene.
- Forsiktig rense lasting brønnene 2 - 3 ganger med 1 x kjører Buffer bruker en pipette. Inverter og forsiktig risting gel kassetten for å fjerne av bufferen for å sikre at det ingen luftbobler i brønnene.
- Fjerne hvite båndet på bunnen av gel kassettene.
- Sett gels (maksimalt to kassetter) gel kjører tank og når ferdig montert, låse gel spenning kile.
- Fyll den øvre (katode) bufferen kammer med 200 mL kjører Buffer til brønnene er helt dekket. Sjekk for eventuelle lekkasjer.
- Legge til 500 µL av antioksidanter (se A14 i Tabellen of Materials) til den kjører bufferen.
Merk: Antioksidant er en anstendighet reagens som skal brukes med prøver med reduksjonsmiddel (se tabell 1) å opprettholde redusert betingelsene under geleelektroforese og for å forhindre re-oksidasjon av sensitive aminosyrer som tryptofan og metionin. - Nøye laste 50 µg av vareprøve per ved hjelp av en pipette. Deretter laste pre farget protein standarden som en molekylær masse markør (se A18 i Tabellen for materiale).
- Fyll nedre (anode) buffer kammeret med 600 mL kjører Buffer.
- Kjøre gelé ~ 60 min med en konstant spenning på 175 V. På slutten av kjøringen, forsiktig fjerne gel fra kassett platen bruker gel kniv.
-
Nøye overføre geléer i en gel flekker boksen.
- Forberede den fikse løsningen frisk basert på antall gels som skal være farget, i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet i tabell 2.
- Riste gel(s) i fikse løsningen for 10 min på RT på en rocking plattform.
-
Forkast fikse løsningen og flekken geléer med kolloidalt blå flekker kit.
- Forberede flekker løsninger frisk basert på antall gels som skal være farget, i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet i tabell 3.
- Først måle riktig volumet og bland direkte komponenter som er merket med en stjerne (*) i gel flekker boksen. Riste gel(s) i flekker løsningen uten fargemaskin B i 10 min på RT på en rocking plattform.
- Legg fargemaskin B direkte til farging boksen inneholder den * flekker løsning. Pass på å riste fargemaskin B godt før bruk.
Forsiktig: Utføre forberedende trinn 7.10.1 og 7.11.1 under avtrekksvifte.
- Riste gel(s) i flekker løsningen over natten for beste samlede resultater.
Merk: Farget bånd blir synlig i 10 min etter tillegg av fargemaskin B. flekker krever minst 3 h og intensiteten ikke varierer hvis venstre for lengre timer i flekker løsningen. - Nøye Dekanter flekker løsningen og erstatte med 200 mL deionisert vann. Rist gel(s) minst 7-8 h i vann for å fjerne bakgrunnen.
Merk: Deionisert vann må endres flere ganger under destaining prosedyren bedre fjerner overdreven stain. Gel(s) kan også stå i vann i opptil 3 dager uten å svekke protein bandet intensiteten. Hvis gel(s) ikke utsettes for de neste trinnene umiddelbart, kan det lagres i 20% ammonium sulfat løsning på 4 ° C for langtidslagring.
8. i-gel Tryptic fordøyelse
Merk: Denne protokollen er ifølge metoden av Sjevtsjenko et al.17, med små modifikasjoner. Denne prosedyren skal utføres i en laminær strømning hette og bruke dedikert Pipetter, tips, rør og glass spesielt for dette formålet. Bruk hansker og riktig lab klær hele tiden å hindre keratin og andre forurensninger. Forberede alle løsninger og reagenser i denne prosedyren kort tid før bruk.
- Avgiftsdirektoratet protein bandene fra gel med rene, nye mikrotomen blad. Skjær bandet i små biter (ca 1 mm x 1 mm til 2 x 2 mm). Nøye overføre gel bitene til 1,5 mL microcentrifuge rør.
Merk: Stykker som er for liten kan tette pipette-spisser og større stykker vil redusere peptid utvinning. Vær forsiktig når du bruker mikrotomen kniver, som er svært skarpe. -
Destaining
- Legg til 500 μL destaining løsning som inneholder 100 mM ABC løsning/ACN (1:1, v/v) og ruge eksempler på RT for 30 min med sporadisk riste eller vortexing.
- Pipetter forsiktig destaining løsningen. Sjekk visuelt for noen rør med gjenværende flekken. Gjenta trinn 8.2.1 Hvis gel stykker er fortsatt farget blå.
-
Reduksjon og alkylation
- Legg ~ 400 µL av nylagde DTT løsning og ruge på 56 ° C for 30 min. Kontroller at løsningen dekker helt gel bitene. Nøye Pipetter redusere løsningen og kast.
- Legg ~ 400 µL av nylagde IAA løsning og ruge i mørket på RT 30 min. Fjern den alkylating buffer med en pipette og kast.
-
Fordøyelse
- Legge 500 µL av pen ACN på RT i 10-15 minutter før gel bitene krympe og blitt ugjennomsiktig. Pipetter ut ACN og air-dry gel stykker for 5-10 min under panseret.
- Pipetter 50 µL av trypsin løsning i hver rør dekker gel bitene. Inkuber rør i 4 ° C i 30 min.
- Etter 30 min, sjekk hver rør hvis alle trypsin løsning har blitt absorbert av gel bitene. Legge til tilstrekkelig volum trypsin bufferen (50-100 µL, avhengig av volumet i røret) dekker gel brikkene, om nødvendig. Inkuber prøvene overnatting på 37 ° C.
-
Peptid utvinning
- Nøye Pipetter utdraget peptid løsningen fra rør og overføre å rengjøre microtubes. Tørr nedbryting i en sentrifugal vakuum fordamperen.
Merk: Ikke kast de resterende gel stykkene. - Legge til 100 µL utvinning bufferen (se trinn 1.7) til hver rør og Inkuber i 30 min på 37 ° C med skjelvende.
- Pipetter nedbryting i den samme microtubes som inneholder de utpakkede peptidene i henhold til de respektive bandene og tørke ned i et vakuum sentrifuge.
Merk: Hvis ikke brukes umiddelbart, kan tørket peptid ekstrakter lagres i 20 ° C til flere måneder før videre bruk.
- Nøye Pipetter utdraget peptid løsningen fra rør og overføre å rengjøre microtubes. Tørr nedbryting i en sentrifugal vakuum fordamperen.
9. peptid rensing
Merk: Denne peptid eksempel avsalte og rensing prosedyren utføres med bruk av C18 pipette-spisser (se C15 i Tabellen for materiale). Bruk nye tips for hvert utvalg.
- Klargjør følgende løsninger frisk konisk sentrifuge rør og aliquot i 2 mL microcentrifuge rør for peptid rensing prosedyren, som vist i Tabell 4. Et sammendrag av rør for peptid rensing er som følger: Tube en (eksempel løsning), Tube B (Wetting løsning), Tube C (balanse løsning), Tube D (vask løsning), Tube E (elueringsrør løsning), Tube F (en tom 2 mL eller 5 mL microcentrifuge rør, avhengig tall å renses, for avfallshåndtering) og Tube G (en ren, tom microtube, kapasitet 0,2 mL).
- Rekonstituer tørket peptid ekstrakter fra trinn 8.6.3 med 10 µL på 0,1% TFA. Dette røret er utpekt Tube A.
- Sonicate rør A i ultralydbad med is 5 min.
- Nedspinning prøve løsningen i en Borstemmaskin centrifuge 1000 x g for 1 min.
- Angi P10 brønnene til maksimal voluminnstilling av 10 µL og fest en C18 pipette tips trygt.
- Dyppe pipette spissen i wetting løsningen (Tube B) og nøye Sug opp i emballasjematerialet. Sakte dispensere avfall inn i røret F. Gjenta dette trinnet minst 7 - 8 ganger.
Merk: Trykke ned pipette stempelet en død stopp og langsomt slipper eller dispensere stempelet i hele denne prosedyren. Ta forholdsregler for ikke å innføre luftbobler i tips under pipettering for å sikre maksimal peptid binding til kolonnen C18. - Equilibrate spissen for peptid bindingen med aspirating 10 µL balanse løsning i rør C. forkaste løsningen, og gjenta dette 3 til 4 ganger.
- Deretter Sug opp og dispensere prøve løsningen i rør A flere ganger (avhengig av tilsvarende gel bandet tykkelsen) Hvis du vil binde peptidene å tipse kolonnen.
Forsiktig: Aspirasjon og dispensering trinnene under binding prosedyren (trinn 9.8) er gjennomført innen Tube A. Ikke dispense eksempel løsning til avfall. - Vask C18 pipette spissen av aspirating vask løsningen i rør D og forkaster det avfall (Tube F) 4 til 5 ganger.
- Endelig elute bundet peptidene av pipettering elueringsrør løsningen (Tube E) og utlevering av eluant inn i rør G.
- Gjenta hele fremgangsmåten 2 til 3 sykluser per å inndrive prøven.
- Kaste spissen etter ett utvalg rensing og bruk nye tips for neste prøven.
- Tørr renset peptid-eluates i et vakuum konsentrator.
Merk: Renset prøvene er nå klar for LC--MS-/ MS analyser i LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS systemet. Lagre tørket prøvene i 20 ° C til fremme bruk.
10. flytende kromatografi-electrospray Ionization--MS-/ MS analyser
Merk: Etikett-fri kvantitative Proteomikk analyse utføres på et flytende kromatografi-electrospray ionization-lineær ion felle-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS system. LC består av Rheos Allegro kvartær pumpe utstyrt med en online degasser (koblet til en HTS PAL autosampler og systemet består av en 30 x 0,5 mm C18 pre kolonne koblet til en 150 x 0,5 mm C18 kolonne. Bruk reversere fase vandig løsemiddel A bestående av LC-MS klasse vann med 0,1% (v/v) maursyre og organisk løsemiddel B bestående av LC-MS klasse acetonitrile med 0,1% (v/v) maursyre. Bruke gradient med en kjøretid på 60 minutter per gel band, som beskrevet i detalj i våre tidligere studier6,16.
- Oppløse renset peptid eksemplene i 10 µL på 0,1% TFA. Sonicate prøvene på is 5 min.
- Pipetter 10 µL prøver i en V-bunn 96-brønns plate og forsegle med en klar, selvklebende dekke film.
- Overføre platen til autosampler.
- Bruk følgende graderingen for hver kjøretid på 60 minutter: 0-35 min (15-40% løsemiddel B), 35-40 min (40-60% løsemiddel B), 40-45 minutter (60-90% løsemiddel B), 45-50 min (90% løsemiddel B), 50-53 min (90-10% løsemiddel B) og 53-60 minutter (10% løsemiddel B).
- Bruk følgende masse spectrometric av instrumentet: positivt ion electrospray ionization modus, spray spenning (2,15 kV), kapillære temperatur (220 ° C), data-avhengige vinningen måte, automatisk oppkjøpet bytte mellom Orbitrap-MULTIPLE Sclerosis og LTQ MS/MS, orbitrap oppløsning (30.000), m/z utvalg (300 til 1,600), målet automatisk få kontroll (AGC, 1.0 x 106 ioner), interne rekalibrering (polydimethlycyclosiloxane [PCM] på m/z 445.120025 ioner i sanntid), låse masse aktivert i MS-modus, tandem data ved å velge fem mest intense forløper ioner, ytterligere fragmentering av kollisjon-indusert dissosiasjon (CID), normalisert kollisjon energi (NCE, 35% med aktivisering tid på 30 ms med gjentakelsestellingen 3) og dynamisk utelukkelse varighet (600 s).
Merk: De resulterende fragmenterte ionene registreres i LTQ. - Kjøre minst tre biologiske replikerer for hvert utvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begrenset utvalg tilgjengelighet er en av de største ulempene ophthalmica forskning. Tilsvarende utvinning metoder for optimal protein avkastning fra små mengder av prøver som okulær blodkar er ofte diskuteres. Dato er det en paucity metoder rettet spesielt for protein utvinning fra retrobulbar blodkar. Derfor, som et første skritt i metoden optimalisering og som et bevis-av-prinsipp å sammenligne effekten og robusthet av flere ofte ansatt protein utvinning vaskemidler til en relativt ny reagens, T-PER, vi gjennomført en pilotstudie bruker hjerte vev fra mus (på grunn av enkel og tilstrekkelig tilgjengelighet for optimering skritt). Vi sammenlignet protein avkastningen ved å sammenligne det totale protein konsentrasjoner og totale proteiner identifisert ved hjelp av følgende reagenser: T-PER, 0.02% n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propan sulfonate (CHAPS), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14) og en blanding av ACN og TFA (20% ACN / 1% TFA). Den totale mengden proteiner i prøver ut med hver av disse rengjøringsmidler er avbildet i figur 6A, med høyest avkastning fra vev utdraget med T-PER (56.4 µg/mg vev), etterfulgt av DDM (22.88 µg/mg vev), CHAPS (16.01 µg/mg vev), ASB-14 (11.56 µg/mg vev) og den laveste avkastningen fra ACN/TFA (4,38 µg/mg vev). Konsekvent, totalt proteiner identifisert var også den høyeste i T-PER-utpakkede prøven (1649 proteiner) > DDM (1310 proteiner) > CHAPS (1319 proteiner) > ASB-14 (1121 proteiner) > ACN/TFA (924 proteiner), som vist i figur 6B. Basert på disse resultatene, vi fortsatte med protein utvinning fra sPCA utvalg T-PER.
Neste, optimalisering av prøven forberedelse protokoller før pre fraksjoneres i 1DE er et svært viktig skritt å få godt atskilt protein band og svært reproduserbar resultater mellom prøver og gjentak. Betydningen av disse trinnene er reflektert og uthevet i resultatene av 1DE. Figur 7 viser sammenligningen av 1DE protein profiler av sPCA før og etter utsatt for optimalisert eksempel utarbeidelsen og rengjøring trinnene. Overall, en høy grad av smøre og dårlig separasjon av protein bandene ble observert på lane 3. Denne profilen viser at prøvene kan inneholde utvinning reagens og også forurensninger som lipider og mobilnettet rusk. Imidlertid sPCA prøvene som ble delt inn i nedbryting pellets og underlegges det optimalisert protokollen resulterte i eksemplarisk 1DE profiler, som representert i lane 1 og 2 (figur 7).
I gist, basert på disse lovende resultater, er metoden optimalisert for rask, robust og effektiv løselig protein utvinning fra okulær microvessels ansette vev protein utvinning reagens (T-PER) og bruke utvinning Buffer 2A (TM-PEK) til å trekke ut membranbasert proteiner som finnes i eksempel-pellets. Deretter prøve homogenates (T-PER brøkdel) er utsatt for bufferen utveksling og prøve rengjøring med 3 kDa sentrifugal filter enheter før 1DE. Optimal eksempel konsentrasjonen er 50 µg per brønn. På den annen side, må det være uthevet her at denne protokollen gjelder ikke bare for liten vev som blod fartøy, men er også mulig for andre vev-basert prøver. Dette er dokumentert av 1DE profiler murine hjernen og hjertet vev, som viste at det er et stort antall proteiner som kan hentes fra nedbryting (Figur 8A, B) og pellets brøker (Figur 8C, D ).
Figur 1 : Oversikt over arbeidsflyt. En skjematisk fremstilling av protokollene ansatt for etikett-fri kvantitative proteom analyse av svin sPCA. Vanligvis er denne fremgangsmåten delt inn i to hoveddeler bestående av microvessel eksempel forberedelsene og baserte Proteomikk tilnærming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant fotografier av svin øynene. (A) Lateral vise av øyet verden viser hornhinnen, som ligger i den fremre delen av øyet, sclera, omkringliggende muskler og synsnerven. (B) bakre vise av øyet viser synsnerven. (C) grener av sPCA sett på baksiden av øyet verden består av paraoptic og distale grener. (D) isolert sPCA med omkringliggende fett og bindevev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Prøve homogenisering. Representant fotografier viser utvalget (A) før og (B) etter homogenisering. (C) den homogenisert prøver ble videre delt inn i nedbryting inneholder løselig proteiner og pellets inneholder uløselig, transmembrane-baserte proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Pellets protein utvinning prosedyre. For å hindre protein rødsprit, pakkes pellet prøvene på is. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Prøve rensning. Buffer exchange utføres med 3 kDa cutoff sentrifugal filtre å rengjøre prøvene før MS analyse. Representant fotografier viser homogenate (A) før og (B) etter filtrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Sammenligning av protein utvinning effektivitet og robusthet mellom T-PER og fire vanlige protein utvinning vaskemidler. Søylediagrammer viser (A) protein beløpene og (B) antall proteiner identifisert ved hjelp av T-PER, 0.02% DDM, 1% CHAPS, 1% ASB-14 og 20% ACN / 1% TFA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Representative 1DE gel av svin sPCA protein profiler før og etter optimaliseringen. Lane 3 viser 1DE profil av utvalg som ikke utsettes for noen før rengjøring trinnene. Lane 1 og 2 viser eksemplarisk protein profiler sPCA supernatant og pellets, henholdsvis etter utsette prøvene for optimalisert eksempel utarbeidelsen og rengjøring trinnene. Gel var farget med kolloidalt blå flekker kit. M = markør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Representant kolloidalt blå-farget 1DE gel av eksemplarisk vev-basert prøver. Protein profiler av nedbryting (A, B) og pellets (C, D) murine hjerne og hjerte vev eksempler, henholdsvis på 50 µg per brønn. Nedbryting og pellets proteiner var utdraget ansette T-PER og transmembrane protein utvinning kit, henholdsvis. M = markør. R1-R3 representerer tre gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Volum (µL) |
| Eksempel (nedbryting eller pellet) | x |
| LDS eksempel Buffer (4 x) | 2.5 |
| Reduksjonsmiddel (10 x) | 1 |
| Deionisert vann | Opptil 6,5 (avhengig av prøven volum) |
| Totalt volum per prøve | 10 |
| Merk: x er beregnet basert på protein konsentrasjonen (50 µg totale protein per prøve). | |
Tabell 1:1 dimensjonal geleelektroforese (1DE). Detaljer om de nødvendige komponentene for eksempel forberedelse til å utføre 1DE.
| Løsning | For 1 gel (mL) | For 2 gels (mL) | For 4 gels (mL) |
| Deionisert vann | 40 | 80 | 160 |
| Metanol | 50 | 100 | 200 |
| Eddiksyre | 10 | 20 | 40 |
Tabell 2: Gel fiksering. Detaljer om komponentene kreves for å forberede fikse løsning for 1DE.
| Løsning | For 1 gel (mL) | For 2 gels (mL) | For 4 gels (mL) |
| * Deionisert vann | 55 | 110 | 220 |
| * Metanol | 20 | 40 | 80 |
| * Fargemaskin A | 20 | 40 | 80 |
| Fargemaskin B | 5 | 10 | 20 |
Tabell 3: Gel flekker. Detaljer av komponenter for utarbeidelse av kolloidalt blå flekker løsning.
| Løsning (for) | Komposisjon | ACN ** | H2O ** | TFA | Totalt volum * |
| Tisse | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing og balanse | 0,1% TFA | 10 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL | |
| Peptid elueringsrør | 0,1% TFA i 60: 40 = ACN: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL |
| Merk: * det totale volumet bør justeres i henhold til totalt antall prøver å bli utsatt for Zip tips rengjøring. | |||||
| ** Bruk mye HPLC-klasse eller LC-MS-klasse. | |||||
| # Forberede to separate Eppendorf rør for vask og balanse, henholdsvis. | |||||
Tabell 4: peptid rensing. Detaljer om komponentene og deres respektive komposisjoner peptid rensing prosedyren ved hjelp av C18 pipette tips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattende proteom profilering av en rekke ulike okulær prøver er et viktig og uunnværlig første skritt å belyse den molekylære mekanismer og signalnettverk trasé innblandet i helse og sykdom. For å oppnå høy kvalitet dataene og sikre reproduserbarhet av resultatene fra disse analysene, foregående eksempel forberedelsene er avgjørende, som fremhevet i en gjennomgang av Mandal et al. som diskuteres grundig eksempel behandling prosedyrer ansette todimensjonal gel gelelektroforese og massespektrometri strategi1for ulike deler av øyet. I linje av disse undersøkelsene gir vår nåværende studien en optimalisert trinnvise protokoll for rask, robust og svært effektiv MS-kompatible eksempel forberedelse på svin sPCA som modell okulær microvessels. Denne etterforskningen ble igangsatt etter mangelen på spesifikke metode å trekke tilstrekkelig mengder proteiner fra parti-begrenset arteriell prøver å generere høy kvalitet MS data. Vår metode er også en forsøke å bidra til den eksisterende kroppen av kunnskap om bruk av mikro-skala teknikker som utmerket proteom kartlegging18.
Det er flere viktige aspekter i denne eksperimentelle protokollen som må tas i betraktning for optimal ytelse for en kvantitativ proteom analyse. Først er det viktig at prøvene, uavhengig av beløp, er utsatt for komplett homogenisering for å sikre optimal protein utvinning. I vår metodikk var bruk av en blanding av ulike størrelse perler og kule blender homogenizer medvirkende for komplett vev lysis. Type og størrelse av perler brukt avhenger av prøven typen og mengden. Perler med høyere tetthet, som for tiden benyttet ZrO2 og rustfritt stål er egnet for middels tøffe vev og fungerte spesielt bra for blodårene.
Det andre er det viktig å skille nedbryting fra pellets og, underlagt sistnevnte fordøyelsen og utvinning ved hjelp av angitte kit. Dette trinnet er viktig for ekstra høy molekylvekt proteiner som transmembrane proteiner, noe som er vanskelig å homogenize bruke milde vaskemidler19,20,21. Utfelt pellet oppløses beste bruker sonication for å unngå eksempel tap påført splash opp introdusert i løpet sprek agitasjon eller riste metoder.
Tredje er det bemerkelsesverdig at alle eksempel forberedelse prosedyrer blir utført ved lav temperatur (4 ° C), med mindre annet er angitt i metodikk. Dette er å sikre minimal protein rødsprit under utvinning prosedyrer. Fjerde, gjentatt fryse-tining av prøver bør unngås for å hindre protein fornedrelse og forringelse av prøven kvalitet.
Endelig er fjerning av miljøgifter og vaskemidler nødvendig etter protein utvinning å hindre nedstrøms forstyrrelser under i-gel fraksjoneres, enzymatisk fordøyelsen og MS analyse18,22. Disse forurensningene forstyrre ofte oppløsningen av electrophoretic separasjon og tilsvarende innflytelse visualisering av resultatet, som vist i 1DE profilen (figur 7). For å omgå dette problemet, foretrukket bruk av sentrifugal cutoff filter enheter for deres brukervennlighet og minimal protein tap.
Selv om de gjeldende eksperimentelle prosedyrene gir en grundig outlook viktige eksempel forberedelsene for optimal etikett-fri kvantitative MS analyser, finnes det to begrensninger. Først ble sPCA prøvene samlet fra svin øyne å skaffe tilstrekkelige mengder av vev for påfølgende analyse. Siden øynene fra den lokale abattoir er randomisert og derfor er det ikke kjent om blodårene er blir isolert fra øynene til samme dyret, begrenser prøve pooling Inter enkeltvarianter5,6. Imidlertid kan gjeldende metodikken også tilpasses for enkelte eksempel forberedelse avhengig av prøver tilgjengelig. Andre er presentert metodikken spesielt utviklet for 1DE gel-baserte fraksjoneres. Selv om kompatibiliteten til det aktuelle metoden for integrering med topp-ned og andre fraksjoneres garanterer etterforskning, valgte vi 1DE på grunn av flere faktorer fra god reproduserbarhet, enkel kvalitet kontroll å bedre dybden av analyser , særlig for komplekse eksempler som er eksemplifisert okulær blodkar1,5,23.
Konklusjon, til tross for begrensningene ovenfornevnte, representerer beskrevet arbeidsflyten en enkel men robust tilnærming til strenge utvalg forberedelsene rettet spesielt for analyse av liten mengde blod fartøy. Det er også viktig å markere her at denne metoden kan integreres lett for masse massespektrometri-baserte proteomic analyse av andre celle - og vev-basert prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dr. Manicam støttes av den interne University forskningsmidler (Stufe 1) fra Universitetet medisinske sentrum av Johannes Gutenberg University Mainz og stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H.
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I.
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
