Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.
Abstract
Zelle Proteome zeichnen sich oft mit Elektrophorese-Assays, wo alle Arten von Proteinen in den Zellen sind unspezifisch mit einer Leuchtstofffärbung beschriftet und sind von einem Photodetektor nach ihrer Trennung entdeckt. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung bieten Gromer Proteindetektion mit seiner Fähigkeit zur Visualisierung von einzelnen fluoreszierende Moleküle. Allerdings wird die Anwendung dieser leistungsstarke bildgebende Methode Elektrophorese-Assays durch den Mangel an Möglichkeiten, um die Homogenität der fluoreszierenden Kennzeichnung der einzelnen Protein-Arten über das Proteom charakterisieren behindert. Hier haben wir eine Methode zur Evaluierung der Kennzeichnung Homogenität über das Proteom basierend auf ein einzelnes Molekül Fluoreszenz imaging Assay entwickelt. In unserer Messung mit Hilfe einer Stichprobe von HeLa-Zelle, der Anteil der Proteine, die mit mindestens einem Farbstoff, der wir genannt “Kennzeichnung Belegung” beschriftet (LO), war entschlossen, Auswahl von 50 % bis 90 %, das hohe Potenzial der Anwendung der Einzelmolekül-Bildgebung zu unterstützen sensibel und präzise Proteomanalyse.
Introduction
Proteomanalyse, deren Ziel es ist, die Gesamtheit der Protein-Moleküle in die Zelle ausgedrückt zu quantifizieren, ist ein wertvoller Ansatz an aktuellen biologischen und medizinischen Studien. Diese Analyse basiert häufig auf Massenspektrometrie, die Protein-Arten anhand der Spektren erzeugt durch Protein Ionisation1,2,3identifiziert. Eine alternative Methode für Proteomanalyse ist Elektrophorese, einschließlich Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Kapillarelektrophorese und zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese. Diese Methode beruht auf unspezifischen fluoreszierende Kennzeichnung der Protein-Moleküle in den analysierten Zellen, gefolgt von elektrophoretischen Trennung und Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Protein-Arten. Zur Erreichung der erforderlichen unspezifische Protein-Kennzeichnung ist eine Strategie, fluoreszierende Farbstoffe zu verwenden, die an Proteine über elektrostatische und hydrophobe Interaktionen, wie Coomassie Blau und Sypro-Ruby4,5,6 binden können . Eine alternative Strategie ist mit kovalente Kennzeichnung mit Farbstoffen mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester oder Maleimide, die kovalent an Proteine durch gemeinsame Rückstände wie primäre Amine und Thiole binden kann, bzw.7, 8.
Unterdessen ist die Nachweisempfindlichkeit Fluoreszenz ideal für Low-Fülle Proteine und kleine Anzahl von Zellen zu analysieren. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung ist eines der empfindlichsten Methoden, die ermöglicht die Erkennung von einzelnen fluoreszierende Farbstoffe und markierte Proteine in Vitro und in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anwendung dieser bildgebenden Methode Elektrophorese basierenden Proteomanalyse wird voraussichtlich hochsensiblen und quantitativen Assays ermöglichen durch individuelle Fluoreszent-markierten Proteinen zählen. Es bleibt unklar, ob Beschriftung mit Fluoreszenzfarbstoffen homogen genug über die Proteinmoleküle ist, und wie diese Homogenität von verschiedenen Protein-Arten (Abbildung 1) betroffen ist. Einfache Masse Lösung Messungen können verwendet werden, um einem Molverhältnis von Fluoreszenzfarbstoffen, Proteine, sogenannte “Kupplung Effizienz”8 oder “Beschriftung Effizienz” zu erhalten, aber diese Eigenschaft liefert keine Informationen über die Homogenität der Beschriftung unter Protein-Moleküle.
Hier beschreiben wir das Protokoll für eine Probe zu untersuchen, die Kennzeichnung Homogenität für alle Arten von Protein in der Zelle (Abbildung 2)16. Die zwei wichtigsten Schritte des Assays sind Proteinreinigung und Bildgebung. Im ersten Schritt alle Proteine in den Zellen sind Eindringmittel beschriftet und biotinylierte, dann extrahiert separat mit Gelelektrophorese gefolgt von Electroelution. Im zweiten Schritt sind Fluoreszenzeigenschaften von einzelnen Protein-Moleküle in den entnommenen Proben anhand des Einzelmolekül-Bildgebung. Aus diesen Daten, Parameter, die wichtig für die Zählung Analyse, wie z. B. der Anteil der Proteine mit mindestens einem beschriftet färben, die wir fordern Kennzeichnung Auslastung (LO)16, und die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gebunden an ein einziges Protein-Molekül (N̄ Farbstoff), charakterisiert werden können. In das Protokoll ein optimiertes Verfahren zur Kennzeichnung der HeLa-Zelle Proteome mit NHS Ester-basierte Cyanin 3 (Cy3) Farbstoff wird exemplarisch dargestellt und kann mit anderen Kennzeichnung Verfahren nach gewünschten Forschungsziele geändert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität der einzelnen markierten Protein-Arten in den Zellen nach der Trennung mit SDS-PAGE (Schritt 3) zu quantifizieren. Das Trennverfahren kann mit anderen Methoden wie flüssige Chromatographie oder Kapillarelektrophorese, ersetzt werden, die Trennung und Fraktionierung von zellulären Proteinen mit hoher Auflösung erfordert spezielle Ausrüstung23ermöglichen. Die Kennzeichnung Methode mit NHS-Ester in das aktuelle Protoko…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Masae Ohno und Kazuya Nishimura für experimentelle Unterstützung und Beratung. Diese Arbeit wurde von PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, Grants-in-aid für junge Wissenschaftler (A) (24687022), anspruchsvolle Pionierforschung (26650055) und wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (23115005), Japan Society for unterstützt. die Förderung der Wissenschaft und durch Zuschüsse von der Takeda Science Foundation und der Mochida Memorial Foundation für medizinische und pharmazeutische Forschung. S.l. räumt Unterstützung aus dem Programm von RIKEN International Programm zuordnen (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referenzen
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
