Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.
Abstract
Célula proteomes caracterizam frequentemente usando ensaios de electroforese, onde todas as espécies de proteínas nas células não-especificamente são rotuladas com um corante fluorescente e são descobertas por uma célula fotoeléctrica após sua separação. Imagens de fluorescência única molécula podem fornecer a deteção de proteínas ultra-sensível com a sua capacidade para visualização de moléculas fluorescentes individuais. No entanto, a aplicação deste método de imagem poderoso para ensaios de electroforese é dificultada pela falta de maneiras de caracterizar a homogeneidade de rotulagem fluorescente de cada espécie de proteína através da proteoma. Aqui, nós desenvolvemos um método para avaliar a homogeneidade de rotulagem através do proteome com base em um ensaio de imagens de fluorescência única molécula. Em nossa medição usando uma amostra de células HeLa, a proporção de proteínas rotulado com pelo menos uma tintura, que nós denominado ‘ocupação de rotulagem’ (LO), determinou-se a escala de 50% a 90%, suportando o elevado potencial da aplicação de imagem única molécula para análise de proteoma sensíveis e precisos.
Introduction
Análise de proteoma, que visa quantificar todo o conjunto de moléculas de proteínas expressado na célula, é uma abordagem valiosa em estudos biológicos e medicamentos atuais. Esta análise baseia-se geralmente na espectrometria de massa, que identifica a espécie de proteína baseado em espectros gerados através da ionização de proteína1,2,3. Um método alternativo para análise de proteoma é electroforese, incluindo a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), eletroforese capilar e eletroforese bidimensional (2D) gel. Este método baseia-se na rotulagem fluorescente específico de todas as moléculas de proteína nas células analisadas, seguidas através de separação eletroforética e detecção e quantificação de cada espécie de proteína. Para atingir a rotulagem obrigatório específico de proteína, uma estratégia é usar tinturas fluorescentes que podem ligar às proteínas através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas, tais como o azul de Coomassie e Ruby-Sypro4,5,6 . Uma estratégia alternativa é usar a rotulagem covalente com corantes contendo éster de N-Hidroxisuccinimida (NHS) ou maleimide, que pode ligar covalentemente a proteínas através de resíduos comuns, tais como aminas primárias e tióis, respectivamente,7, 8.
Entretanto, a sensibilidade da deteção de fluorescência é ideal para a análise de proteínas de baixo-abundância e pequeno número de células. Imagens de fluorescência única molécula é um dos métodos mais sensíveis que permite a detecção de corantes fluorescentes individuais e as proteínas etiquetadas em vitro e in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Aplicação deste método de imagem para análise de proteoma baseada em eletroforese é esperada para permitir ensaios altamente sensíveis e quantitativos pela contagem individuais proteínas fluorescente-labeled. No entanto, isso ainda não está claro se etiquetando com corantes fluorescentes é bastante homogêneo em todas as moléculas de proteína, e como esta homogeneidade é afectada por espécies diferentes proteínas (Figura 1). Medições de solução simples em massa podem ser usadas para obter uma relação molar de corantes fluorescentes para proteínas chamadas ‘eficiência de acoplamento’8 ou ‘rotulagem eficiência’, mas essa propriedade não fornece informações de homogeneidade a rotulagem entre moléculas de proteína.
Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio investigar a homogeneidade de rotulagem para todas as espécies de proteína no celular (Figura 2)16. As duas principais etapas deste teste são imagens e purificação de proteínas. Na primeira etapa, todas as proteínas nas células fluorescente são rotuladas e biotinilado, então extraído separadamente usando electroforese em gel, seguido por electroelution. Na segunda etapa, propriedades de fluorescência de moléculas de proteínas individuais nas amostras extraídas são avaliadas com base na imagem única molécula. Estes dados, parâmetros importantes para a análise de contagem, tais como a percentagem de proteínas rotulado com pelo menos um corante, o que chamamos de rotulagem de ocupação (LO)16, e o número médio de corantes fluorescentes ligadas a uma molécula de proteína única (n̄ corante), pode ser caracterizado. No protocolo, um processo otimizado para rotular o célula HeLa proteome com tintura de cianina 3 (Cy3) baseados em éster NHS é apresentado como um exemplo e pode ser modificado com outros procedimentos de rotulagem de acordo com os objectivos de pesquisa desejado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um protocolo para quantificar a homogeneidade de rotulagem de cada espécie de etiquetado proteína nas células após a separação com SDS-PAGE (etapa 3). O método de separação pode ser substituído por outros métodos, como a cromatografia líquida ou eletroforese capilar, que permitem a separação e fracionamento das proteínas celulares com alta resolução, exigindo equipamentos especiais23. O método de rotulagem utilizando NHS-éster no protocolo atual pode ser sub…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores Obrigado Masae Ohno e Kazuya Nishimura para aconselhamento e assistência experimental. Este trabalho foi apoiado por PRESTO (JPMJPR15F7), Japão de ciência e tecnologia agência, Grants-in-aid para jovens cientistas (A) (24687022), pesquisa exploratória desafiador (26650055) e pesquisa científica em áreas inovadoras (23115005), sociedade de Japão para a promoção da ciência e por doações da Fundação de ciência de Takeda e Fundação Memorial Mochida para pesquisa farmacêutica e médica. S.L. reconhece o apoio do programa de RIKEN internacional programa associar (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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