La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nella messa a fuoco epilettica previene le convulsioni nei topi
Summary
La sfida della ricerca sull’epilessia è sviluppare nuovi trattamenti per i pazienti in cui la terapia classica è inadeguata. Utilizzando un nuovo protocollo — con l’aiuto di un sistema di somministrazione di farmaci impiantabili — siamo in grado di controllare le convulsioni in topi anestetizzati dalla consegna elettroforetica di GABA nella messa a fuoco epilettica.
Abstract
L’epilessia è un gruppo di disturbi neurologici che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. Anche se il trattamento con farmaci è utile nel 70% dei casi, gravi effetti collaterali influenzano la qualità della vita dei pazienti. Inoltre, un’alta percentuale di pazienti epilettici è resistente ai farmaci; nel loro caso, neurochirurgia o neurostimolazione sono necessari. Pertanto, l’obiettivo principale della ricerca sull’epilessia è quello di scoprire nuove terapie che sono in grado di curare l’epilessia senza effetti collaterali o prevenire le convulsioni ricorrenti in pazienti resistenti ai farmaci. NeuroEngineering fornisce nuovi approcci utilizzando nuove strategie e tecnologie per trovare soluzioni migliori per curare i pazienti epilettici a rischio.
Come dimostrazione di un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di epilessia del topo, viene utilizzato un sistema di somministrazione di farmaci elettroforetici diretto in situ. Vale a dire, una sonda neurale che incorpora una pompa a ioni microfluidica (μFIP) per la somministrazione di farmaci on-demand e la registrazione simultanea dell’attività neurale locale è impiantata e dimostrata in grado di controllare la crisi indotta da 4-aminopiridina (indotta da 4AP) l’attività dell’evento (SLE). La concentrazione di acido γ-aminobutirrico (GABA) è mantenuta nella gamma fisiologica dal controllo preciso della consegna di GABA per raggiungere un effetto antiepilettico nella messa a fuoco convulsiva, ma non causare esplosioni di rimbalzo indotta da iperinibizione. Il metodo consente sia il rilevamento di attività patologica e l’intervento per fermare le convulsioni, fornendo neurotrasmettitori inibitorio direttamente al focus epilettico con preciso controllo spaziotemporale.
Come risultato degli sviluppi al metodo sperimentale, SLEs possono essere indotti in un modo altamente localizzato che consente il controllo delle convulsioni dalla consegna di GABA precisamente sintonizzati all’inizio della crisi.
Introduction
L’epilessia è il quarto disturbo neurologico più comune: circa l’1% della popolazione soffre di epilessia, e circa un terzo delle persone colpite ha convulsioni ricorrenti. Nella maggior parte dei casi, le convulsioni possono essere controllate con farmaci. Tuttavia, il trattamento farmacologico deve essere impostato per ogni paziente individualmente, dove il dosaggio corretto può richiedere anni per trovare1,2. Inoltre, la maggior parte del farmaco ha gravi effetti collaterali che riducono la qualità della vita3,4,5,6,7. Infine, nel 30% dei casi i pazienti sono resistenti ai farmaci, e nel caso di un singolo locus generatore di convulsioni costante, solo la neurochirurgia resettiva può attenuare il verificarsi di convulsioni8. Pertanto, una grande iniziativa nella ricerca moderna sull’epilessia è quella di scoprire nuove strategie che possono prevenire le convulsioni ricorrenti nei pazienti a rischio, riducendo al contempo la necessità di terapie farmacologiche forti e interventi chirurgici reinvettivi invasivi.
Crisi epilettiche si verificano quando c’è uno squilibrio all’interno di circuiti eccitatori e inibitorie sia in tutto il cervello (epilessia generalizzata) o in una parte localizzata del cervello (epilessia focale), tale che i neuroni scaricano in modo anormale9 , 10 il , 11. farmaci antiepilettici possono agire in due modi diversi nella prevenzione delle convulsioni: o diminuire l’eccitazione o migliorare l’inibizione12. In particolare, possono modificare l’attività elettrica delle cellule neuronali influenzando i canali ionici nella membrana cellulare13 o agiscono sulla trasmissione chimica tra i neuroni influenzando il neurotrasmettitore inibitorio GABA o il eccitatorio glutammato nelle sinapsi14,15. Per alcuni farmaci, la modalità di azione è sconosciuta18. Inoltre, i trattamenti farmacologici hanno un effetto continuo sui pazienti e non possono adattarsi alle dinamiche di prevalenza delle convulsioni. Idealmente, i farmaci con meccanismi di azione specifici agirebbero sui processi epilettici sottostanti. Un trattamento ottimale non toccherà il cervello Interictally ma avrebbe agito immediatamente quando un sequestro inizia a svilupparsi. A differenza di ciò, in tutti i casi di epilessia, il farmaco ora significa un trattamento sistematico, che colpisce tutto il cervello e tutto il corpo del paziente9.
Le convulsioni epilettiche possono comparire molti anni dopo l’insulto iniziale, come il trauma cerebrale. Il periodo tra l’insulto iniziale e il verificarsi delle prime convulsioni spontanee è caratterizzato da notevoli riorganizzazioni molecolari e cellulari, tra cui la morte neuronale con la scomparsa di connessioni di rete neuronale e assonale germogliare/neosinaptogenesi con la comparsa di nuove connessioni19,20,21. Una volta che le convulsioni diventano ricorrenti, la loro frequenza e gravità tendono ad aumentare, coinvolgendo più regioni cerebrali. È importante distinguere i siti di insorgenza convulsiva (regioni epilettogene) dalle reti di propagazione, poiché le regole della Genesi e della propagazione delle convulsioni possono differire. La ricerca condotta sul tessuto umano e i modelli sperimentali di epilessia hanno fornito dati importanti riguardanti la riorganizzazione dei circuiti e la loro capacità di generare convulsioni20,21,22, 23. Tuttavia, è difficile determinare se queste riorganizzazioni siano risposte adattive o se siano causalmente correlate all’epilettitesi o alla genesi del sequestro e alla propagazione12.
Pertanto, localizzare la messa a fuoco epilettica e l’applicazione di farmaci antiepilettici localmente sono una delle principali sfide nella ricerca dell’epilessia contemporanea. Diversi esperimenti che utilizzano modelli animali di epilessia e alcuni studi clinici miravano a trovare l’insorgenza degli eventi convulsivi e a definire i meccanismi di base nel cervello24,25,26,27. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo sperimentale che utilizza l’epilessia indotta da 4AP modello28,29,30,31 in una preparazione acuta del topo, che permette l’inserimento preciso di tre dispositivi nella zona data dell’ippocampo, dove l’attività di rete in vivo è manipolata in modo altamente localizzato. L’iniezione localizzata di 4AP da parte di una micropipetta di vetro aiuta a indurre gli SLEs epilettici in un punto localizzato nell’ippocampo, mentre con l’aiuto della nuova sonda μFIP a base polimerica il controllo dell’attività convulsiva si ottiene simultaneamente registrando il neuronale l’attività elettrica con i siti di registrazione del dispositivo. L’attività del campo locale hippocampal è monitorata anche con una sonda in silicio multicanale in modo specifico strato nella corteccia e nell’ippocampo simultaneamente.
Le sonde μFIP recentemente inventate funzionano utilizzando un campo elettrico applicato per spingere i farmaci caricati immagazzinati in un canale microfluidico attraverso una membrana di scambio ionico (IEM) e verso il tessuto circostante (Figura 1). L’IEM trasporta selettivamente solo un tipo di ione (catione o anione) e, quindi, lavora per limitare la diffusione passiva nello stato “spento” e il trasporto di specie cariche opacemente dal tessuto circostante nel dispositivo. Il campo elettrico viene creato su richiesta applicando una piccola tensione (< 1 V) tra l'elettrodo sorgente che è interno al canale microfluidico e un elettrodo target che è esterno al dispositivo (in questo caso, la vite a testa sul modello animale). Il tasso di erogazione del farmaco è proporzionale alla tensione applicata e alla corrente misurata tra gli elettrodi di origine e di destinazione. La precisa accordabilità della somministrazione di farmaci è uno dei principali vantaggi del μFIP. Un altro vantaggio critico, rispetto ai sistemi di erogazione di farmaci fluidici o basati sulla pressione, è che nel μFIP c'è solo un aumento di pressione trascurabile all'uscita di erogazione del farmaco poiché i farmaci vengono consegnati attraverso l'IEM senza la loro soluzione Carrier.
C’è una piccola quantità di perdite passive di GABA quando il μFIP è “spento”, ma questo è stato trovato non per effetto SLEs. I μFIP sono fatti su misura seguendo i metodi di microfabbricazione convenzionali che abbiamo riferito in precedenza31.
Dal momento che un modo di prevenire le convulsioni ricorrenti è il blocco delle scariche di rete all’inizio o anche prima del primo evento convulsivo, il metodo presentato per la consegna del neurotrasmettitore inibitorio GABA nella messa a fuoco epilettica ha grande potenziale terapeutico per il controllo delle convulsioni in pazienti con epilessia focale. Dal momento che il GABA è un substrato endogeno, lascia proprietà neuronali intrinseche invariate in concentrazioni fisiologiche. L’applicazione locale di bassi livelli di GABA influenzerà solo le cellule naturalmente reattivo all’inibizione, e causerà solo effetti simili all’inibizione fisiologica, contrariamente alla stimolazione cerebrale profonda (DBS), che ha azioni non specifiche stimolando tutte le cellule della rete neuronale nel suo ambiente, causando una risposta mista che coinvolge sia l’eccitazione che l’inibizione. In conclusione, il metodo proposto fornisce un approccio più specifico al controllo delle convulsioni rispetto alla DBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppando un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di topo di epilessia, le SLEs potrebbero essere controllate con successo con l’aiuto di un μFIP impiantato nel focus epilettico. Grazie alla sua capacità di fornire GABA con precisione temporale e spaziale, le SLEs indotta da 4AP sono state controllate all’inizio delle convulsioni. Il trattamento dell’epilessia è teoricamente possibile se il controllo delle scariche di rete neurale viene raggiunto nel luogo dell’inizio della crisi. Il protocollo presenta…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M.P. riconosce il finanziamento di una sovvenzione Whitaker International Scholar amministrata dall’Istituto per l’educazione internazionale. A.K. è stato sponsorizzato dall’IEF Marie Curie (n. 625372). Il programma di ricerca e innovazione dell’Unione europea Horizon 2020 (accordo di sovvenzione n. 716867) riconosce i finanziamenti del Consiglio europeo della ricerca (CER). Inoltre, l’iniziativa di eccellenza dell’Università di Aix-Marseille-A * MIDEX, un programma francese “investissements d’Avenir”. Gli autori riconoscono il dottor Ilke Uguz, Dr. Sahika inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, e Zsófia Maglóczky per la loro partecipazione a proficue discussioni.
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
Referenzen
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neurowissenschaften. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
