El reto de la investigación de la epilepsia es desarrollar tratamientos novedosos para los pacientes donde la terapia clásica es inadecuada. El uso de un nuevo protocolo — con la ayuda de un sistema de administración de fármacos implantables — somos capaces de controlar las convulsiones en ratones anestesiados por la entrega electroforética de GABA en el foco epiléptico.
La epilepsia es un grupo de trastornos neurológicos que afecta a millones de personas en todo el mundo. Aunque el tratamiento con medicamentos es útil en el 70% de los casos, los efectos secundarios graves afectan la calidad de vida de los pacientes. Por otra parte, un alto porcentaje de pacientes epilépticos son farmacorresistentes; en su caso, se necesita neurocirugía o neuroestimulación. Por lo tanto, el objetivo principal de la investigación de la epilepsia es descubrir nuevas terapias que sean capaces de curar la epilepsia sin efectos secundarios o prevenir convulsiones recurrentes en pacientes farmacorresistentes. La neuroingeniería proporciona nuevos enfoques mediante el uso de nuevas estrategias y tecnologías para encontrar mejores soluciones para curar a los pacientes epilépticos en riesgo.
Como demostración de un novedoso protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de epilepsia, se utiliza un sistema de administración de fármacos electroforéticos directos in situ. Es decir, una sonda neuronal que incorpora una bomba de iones de microfluidos (μFIP) para la entrega de fármacos bajo demanda y la grabación simultánea de la actividad neuronal local se implanta y se demuestra que es capaz de controlar las convulsiones inducidas por 4-aminopyridina (inducida por 4AP) como actividad del evento (SLE). La concentración de ácido γ-aminobutírico (GABA) se mantiene en el rango fisiológico por el control preciso de la entrega de GABA para alcanzar un efecto antiepiléptico en el foco de convulsiones pero no causar explosiones de rebote inducida por sobreinhibición. El método permite tanto la detección de la actividad patológica como la intervención para detener las convulsiones mediante la entrega de neurotransmisores inhibitorios directamente al foco epiléptico con control espaciotemporal preciso.
Como resultado de los desarrollos para el método experimental, SLEs se puede inducir de una manera altamente localizada que permite el control de las convulsiones por la entrega de GABA afinado con precisión en el inicio de la convulsión.
La epilepsia es el cuarto trastorno neurológico más común: alrededor del 1% de la población sufre de epilepsia, y alrededor de un tercio de los afectados presentan convulsiones recurrentes. En la mayoría de los casos, las convulsiones se pueden controlar con medicamentos. Sin embargo, el tratamiento farmacológico debe establecerse para cada paciente individualmente, donde la dosificación adecuada puede tomar años para encontrar1,2. Además, la mayoría de los medicamentos tiene efectos secundarios graves que reducen la calidad de vida3,4,5,6,7. Por último, en el 30% de los casos los pacientes son resistentes a la medicación, y en el caso de un locus único generador de convulsiones, sólo la neurocirugía resectiva puede atenuar la ocurrencia de convulsiones8. Por lo tanto, una iniciativa importante en la investigación de la epilepsia moderna es descubrir nuevas estrategias que pueden prevenir las convulsiones recurrentes en pacientes en riesgo, reduciendo la necesidad de terapias farmacológicas fuertes y cirugías resectivas invasivas.
Las convulsiones epilépticas ocurren cuando hay un desequilibrio dentro de los circuitos excitatorios e inhibitorios en todo el cerebro (epilepsia generalizada) o en una parte localizada del cerebro (epilepsia focal), de tal manera que las neuronas se descargan de forma anormal9 , 10 , 11. los fármacos antiepilépticos pueden actuar de dos maneras diferentes en la prevención de convulsiones: disminución de la excitación o aumento de la inhibición12. Específicamente, pueden o bien modificar la actividad eléctrica de las células neuronales afectando a los canales de iones en la membrana celular13 o actuar sobre la transmisión química entre las neuronas al afectar el neurotransmisor inhibitorio GABA o el excitatorio glutamato en las sinapsis14,15. Para algunos medicamentos, el modo de acción es desconocido18. Además, los tratamientos farmacológico tienen un efecto continuo en los pacientes y no pueden adaptarse a la dinámica de prevalencia de las convulsiones. Idealmente, los fármacos con mecanismos específicos de acción actuarían sobre los procesos epilépticos subyacentes. Un tratamiento óptimo no tocaría el cerebro interictally pero actuaría inmediatamente cuando una convulsión empiece a desarrollarse. En contraste con eso, en todos los casos de epilepsia, la medicación ahora significa un tratamiento sistemático, afectando todo el cerebro y todo el cuerpo del paciente9.
Las convulsiones epilépticas pueden aparecer muchos años después del insulto inicial, como el trauma cerebral. El período entre el insulto inicial y la ocurrencia de las primeras convulsiones espontáneas se caracteriza por considerables reorganizaciones moleculares y celulares, incluyendo la muerte neuronal con la desaparición de las conexiones de red neuronal y axonal brotación/neosinaptogénesis con la aparición de nuevas conexiones19,20,21. Una vez que las convulsiones se vuelven recurrentes, su frecuencia y severidad tienden a aumentar, involucrando más regiones cerebrales. Es importante distinguir los sitios de aparición de convulsiones (regiones epileptogénicas) de las redes de propagación, ya que las normas de la génesis y la propagación de las convulsiones pueden diferir. Las investigaciones realizadas sobre el tejido humano y los modelos experimentales de epilepsia han proporcionado datos importantes sobre la reorganización de los circuitos y su capacidad para generar convulsiones20,21,22, 23. sin embargo, es difícil determinar si estas reorganizaciones son respuestas adaptativas o si están relacionadas causalmente con la epileptogénesis o el embargo Génesis y la propagación12.
Por lo tanto, localizar el enfoque epiléptico y la aplicación de fármacos antiepilépticos localmente son uno de los principales desafíos en la investigación de la epilepsia contemporánea. Varios experimentos con modelos animales de epilepsia y algunos estudios clínicos apuntan a encontrar la aparición de los eventos convulsivos y definir los mecanismos subyacentes en el cerebro24,25,26,27. Con este fin, desarrollamos un nuevo protocolo experimental utilizando el modelo de epilepsia inducida por 4AP28,29,30,31 en una preparación aguda del ratón, que permite la inserción precisa de tres dispositivos en el área dada del hipocampo, donde la actividad de la red in vivo se manipula de una manera altamente localizada. La inyección localizada de 4AP por una micropipeta de vidrio ayuda a inducir los SLEs epilépticos en un lugar localizado en el hipocampo, mientras que con la ayuda de la nueva sonda μFIP basada en polímeros, el control de la actividad convulsiva se logra simultáneamente registrando el actividad eléctrica con los sitios de grabación del dispositivo. La actividad de campo local hippocampal también se supervisa con una sonda de silicio multicanal de una manera específica de la capa en la corteza y en el hipocampo simultáneamente.
Las sondas μFIP recientemente inventadas funcionan mediante el uso de un campo eléctrico aplicado para empujar los fármacos cargados almacenados en un canal de microfluidos a través de una membrana de intercambio de iones (IEM) y hacia el tejido circundante (figura 1). El IEM transporta selectivamente sólo un tipo de iones (cationes o aniones) y, por lo tanto, trabaja para limitar la difusión pasiva en el estado “apagado” y el transporte de especies cargadas de forma opuesta del tejido circundante al dispositivo. El campo eléctrico se crea bajo demanda aplicando un pequeño voltaje (< 1 V) entre el electrodo de origen que es interno al canal de microfluidos y un electrodo de destino que es externo al dispositivo (en este caso, el tornillo de cabeza en el modelo animal). La tasa de entrega de fármacos es proporcional a la tensión aplicada y la corriente medida entre los electrodos de origen y de destino. La tunabilidad precisa de la administración de fármacos es una de las principales ventajas de la μFIP. Otra ventaja crítica, en comparación con los sistemas de administración de fármacos a base de fluidos o de presión, es que en el μFIP sólo hay un aumento de presión insignificante en la salida de suministro de fármacos, ya que los fármacos se entregan a través del IEM sin su solución portadora.
Hay una pequeña cantidad de fuga pasiva de GABA cuando el μFIP es “apagado”, pero esto fue encontrado para no efecto SLEs. Los μFIP son hechos a medida siguiendo los métodos convencionales de microfabricación que hemos reportado anteriormente31.
Dado que una manera de prevenir las convulsiones recurrentes es el bloqueo de las descargas de la red en el principio o incluso antes del primer evento convulsivo, el método presentado para entregar el neurotransmisor inhibitorio GABA en el enfoque epiléptico tiene gran potencial terapéutico para el control de las convulsiones en pacientes con epilepsia focal. Puesto que el GABA es un sustrato endógeno, deja propiedades neuronales intrínsecas sin cambios en las concentraciones fisiológicas. La aplicación local de bajos niveles de GABA sólo afectará a las células naturalmente sensibles a la inhibición, y sólo causará efectos similares a la inhibición fisiológica, contrariamente a la estimulación cerebral profunda (DBS), que tiene acciones inespecíficas estimulando todas las células de la red neuronal en su entorno, causando una respuesta mixta que involucra tanto la excitación como la inhibición. En conclusión, el método propuesto proporciona un enfoque más específico para el control de las convulsiones que el DBS.
Mediante el desarrollo de un nuevo protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de la epilepsia, SLEs podría ser controlado con éxito con la ayuda de un μFIP implantado en el foco epiléptico. Gracias a su capacidad para entregar GABA con precisión temporal y espacial, SLEs inducida por 4AP fueron controlados en el inicio de las convulsiones. El tratamiento de la epilepsia es teóricamente posible si se logra el control de las descargas de la red neuronal en el lugar del inicio de la convulsión. El protocolo …
The authors have nothing to disclose.
C.M.P. reconoce la financiación de una beca de Whitaker International académico administrada por el Instituto de educación internacional. A.K. fue patrocinado por el IEF Marie Curie (núm. 625372). A.W. reconoce la financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizon 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención Nº 716867). A.W. reconoce además la iniciativa Excellence de la Universidad de Aix-Marseille-A * MIDEX, un programa francés de “investissements d’Avenir”. Los autores reconocen al Dr. ILKE Uguz, al Dr. Sahika inal, al Dr. Vincenzo Curto, a la Dra. Mary Donahue, al Dr. Marc Ferro y a Zsófia Maglóczky por su participación en debates fructíferos.
4AP | Sigma | 275875 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Connector | INSTECH | SC20/15 | |
Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
DMSO | Sigma | 11412-11 | |
Drill | FOREDOM | K1070 | |
Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
GABA | Sigma | A2129 | |
GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
GOPS | Sigma | 440167-100M | |
Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
Keithley | Tektoronix | 216A | |
Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
Mice | Charles River | 612 | |
Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
PB | Sigma | P4417 | |
PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
Saline | Sigma | 7982 | |
Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
Seringue | BD Medical | 324826 | |
Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
Tubing | INSTECH | LS20 | |
Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
Xylazine | Bayer | 4007221032311 |