희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별
Summary
이 연구는 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성하기 위해 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 기존의 독성 아날로그 기반 방법에 대한 대체 전략을 제시합니다.
Abstract
아미노산에 대한 계속 성장하는 시장을 만족시키기 위해서는 고성능 생산 균주가 필요합니다. 아미노산 과잉 생산자는 아미노산과 그들의 유사체 사이 경쟁을 이용하 여 전통적으로 확인됩니다. 그러나, 이 아날로그 기반 방법은 낮은 정확도이며, 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체는 제한된다. 여기에서는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 민감하며 처리량이 높은 스크리닝을 가능하게 하는 대체 전략을 제시합니다. 이 전략은 코돈이 코딩 DNA에서 발생 빈도에 따라 일반적이거나 희귀 한 것으로 분류되는 단백질 번역에서 코돈 사용 편향현상에서 영감을 받습니다. 희귀 코돈의 번역은 기아하에 코그네이트 아미노산에 의해 완전히 충전 될 수없는 해당 희귀 전사 RNAs (tRNAs)에 달려 있습니다. 이론적으로, 희귀 한 tRNAs는 동의어 일반적인 이소 수용인을 충전 한 후 아미노산의 잉여가있는 경우 충전 될 수있다. 따라서, 희소한 코돈에 기인한 지체번역은 대응하는 아미노산의 공급 또는 세포내 과잉 생산에 의해 복원될 수 있었다. 이러한 가정하에, 표적 아미노산의 일반적인 코돈들을 항생제 내성 유전자 또는 유전자의 동의어드문 대안으로 대체함으로써 아미노산 과잉 생산자를 식별하기 위한 선택 또는 스크리닝 시스템이 확립된다. 형광 또는 발색성 단백질을 인코딩합니다. 우리는 단백질 발현이 희소한 코돈의 통합에 의해 크게 방해될 수 있고 단백질의 수준이 아미노산 농도와 긍정적으로 상관관계가 있다는 것을 보여줍니다. 이 시스템을 사용 하 여, 여러 아미노산의 과잉 생산자 돌연변이 라이브러리에서 쉽게 밖으로 선별 될 수 있습니다. 이 희소한 코돈 기지를 둔 전략은 단지 단 하나 수정한 유전자를 요구하고, 호스트는 그밖 방법에서 보다는 선택을 탈출하기 위하여 확률이 낮습니다. 그것은 아미노산 과잉 생산자를 얻기 위한 대체 접근 을 제안 합니다.
Introduction
아미노산의 현재 생산 발효에 크게 의존. 그러나, 대부분의 아미노산 생산 균주에 대한 적시및 수율은 수십억 달러의 가치가 있는 글로벌 아미노산 시장의 수요 증가에 미치지못하고1,2. 고성능 아미노산 과잉 생산자를 얻는 것은 아미노산 산업의 업그레이드에 매우 중요합니다.
아미노산 과잉 생산자를 식별하는 전통적인 전략은 단백질 합성에서 아미노산과 그유사체 사이의 경쟁을 악용 3,4. 이들 유사체는 상응하는 아미노산을 인식하고 펩티드 사슬의 연신을 억제하는 tRNAs를 충전할 수 있으며, 이는 체포된 성장 또는 세포 사멸을 초래한다5. 아날로그 응력에 저항하는 한 가지 방법은 세포 내 아미노산의 농도를 증가시키는 것입니다. 농축 된 아미노산은 유한 tRNAs에 대한 유사체를 능가하고 기능성 단백질의 올바른 합성을 보장합니다. 따라서, 유사체에서 살아남는 균주를 선택할 수 있고 상응하는 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 있다.
L-류신 6와 같은 아미노산에 대한 과잉 생산자를선택하는 데 성공했지만 아날로그 기반 전략은 심각한 단점을 겪고 있습니다. 한 가지 주요 관심사는 돌연변이 발생 의 과정에서 또는 자발적인 돌연변이를 통해 서 유래 아날로그 저항이다. 저항이있는 균주는 아날로그5를차단, 내보내기 또는 저하시켜 선택을 벗어날 수 있습니다. 또 다른 관심사는 다른 세포 과정에 아날로그의 독성 부작용7. 결과적으로, 아날로그 선택에서 살아남은 균주는 아미노산 과잉 생산자가 아닐 수 있으며, 원하는 과잉 생산자는 부정적인 부작용으로 인해 거짓으로 박멸 될 수 있습니다.
여기서, 코돈 편향의 법칙에 기초한 새로운 전략이 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 달성하기 위해 제시된다. 대부분의 아미노산은 숙주 유기체8,9에의해 다르게 선호되는 하나 이상의 뉴클레오티드 삼중항에 의해 인코딩된다. 몇몇 코돈은 코딩 순서에서 드물게 사용되지 않으며 희소한 코돈으로 불립니다. 아미노산으로의 그들의 번역은 해당 아미노산을 운반하는 코그네이트 tRNAs에 의존합니다. 그러나, 희귀 코돈 인식 하는 tRNAs는 일반적으로 일반적인 코돈10,11의tRNAs 보다 훨씬 낮은 풍부. 따라서, 이러한 희귀 한 tRNAs는 다른 이소 수용자와의 경쟁에서 자유 아미노산을 포착 할 가능성이 적으며, 희귀 코돈이 풍부한 서열의 번역은 감속하기 시작하거나 아미노산의 양이 제한될 때 종료됩니다. 10. 번역은, 이론적으로, 해당 아미노산의 과잉 생산 또는 추가 공급으로 인해 동의어 일반적인 tRNAs를 충전 한 후 아미노산 잉여가있는 경우 복원 될 수있다12. 희소코돈이 풍부한 유전자가 선택 또는 스크리닝 마커를 인코딩하는 경우, 상응하는 표현형을 나타내는 균주는 쉽게 식별될 수 있으며 표적 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 높습니다.
상기 전략은 아미노산 과잉 생산자의 식별을 위한 선택 및 스크리닝 시스템을 확립하기 위해 적용된다. 선택 시스템은 항생 저항 유전자(예를 들어, kan R)를 마커로서 사용하며, 스크리닝 시스템은 형광(예를 들어, 녹색 형광 단백질[GFP]) 또는 염색체성(예를 들어, PrancerPurple) 단백질을 인코딩하는 유전자를 사용한다. 두 시스템의 마커 유전자는 그것의 동의어 드문 대안으로 표적 아미노산에 대한 일반적인 코돈의 정의 된 숫자를 대체하여 수정됩니다. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 수용하는 돌연변이 라이브러리의 균주는 적절한 조건 하에서 선택되거나 스크리며, 표적 아미노산의 과잉 생산자는 쉽게 식별될 수 있다. 워크플로우는 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자 시스템의 구축으로 시작하여 작업 조건의 최적화를 거친 다음 아미노산 과잉 생산자의 식별 및 검증을 수행합니다. 이 아날로그 독립적 인 전략은 단백질 번역의 교리를 기반으로하며 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 가능하게하는 실질적으로 검증되었습니다. 이론적으로, 그것은 직접 희귀 코돈과 모든 미생물 아미노산에 고용 될 수 있습니다. 대체로, 희귀 코돈 기반 전략은 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체를 사용할 수 없거나 높은 거짓 긍정률이 주요 관심사인 경우 기존의 아날로그 기반 접근법에 대한 효율적인 대안으로 작용할 것입니다. 아래 프로토콜은 대장균 L-류신 과잉 생산자를 식별하는 이 전략을 입증하기 위해 류신 희귀 코동을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마커 유전자및 선택 또는 스크리닝 배지에서 희귀 코돈의 수는 희귀 코돈 변형 마커 유전자로부터단백질 발현을 억제하는 데 중요하다. 야생형 마커 유전자와 이들의 유도체로부터의 단백질 발현 사이에 유의한 차이가 검출되지 않으면, 희귀 코돈의 수를 증가시키거나 영양분 제한 배지를 사용하여 차이를 증폭시킬 수 있다. 그러나, 억제 효과가 너무 강한 경우, 단백질 발현은 해당 아미노산의 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(보조금 제21676026호), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0201400), 중국 박사후 과학 재단(2017M620643)이 공동으로 지원했습니다. UCLA 진보 연구소 (소주)의 작품은 장쑤성과 쑤저우 산업 단지의 내부 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
Referenzen
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