Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

Summary

Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.

Abstract

Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.

Introduction

La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares^1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.

La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos y sus análogos en la síntesis de proteínas 3,^4. Estos análogos son capaces de cargar los tRNA que reconocen los aminoácidos correspondientes y así inhibir las elongaciones de las cadenas de péptidos, lo que conduce a un crecimiento detenido o muerte celular⁵. Una manera de resistir las tensiones analógicas es aumentar las concentraciones de aminoácidos intracelulares. Los aminoácidos enriquecidos superarán a los análogos para los tRNA finitos y asegurarán la síntesis correcta de proteínas funcionales. Por lo tanto, las cepas que sobreviven a los análogos pueden ser seleccionados y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos correspondientes.

Aunque resultó exitoso en la selección de los sobreproductores para aminoácidos como L-leucina⁶, la estrategia basada en analógico sufren de graves inconvenientes. Una preocupación importante es la resistencia analógica originada por el proceso de mutagénesis o a través de mutaciones espontáneas. Las cepas con resistencia pueden escapar de la selección bloqueando, exportando o degradando los análogos⁵. Otra preocupación son los efectos secundarios tóxicos de los análogos en otros procesos celulares⁷. Como consecuencia, las cepas que sobreviven a la selección analógica pueden no ser los sobreproductores de aminoácidos, mientras que los sobreproductores deseados podrían ser falsamente exterminados debido a los efectos secundarios negativos.

Aquí, se presenta una estrategia novedosa basada en la ley del sesgo de codón con el fin de lograr identificaciones precisas y rápidas de los sobreproductores de aminoácidos. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un triplete de nucleótidos que es favorecido de manera diferente por los organismos huésped^8,9. Algunos codones rara vez se utilizan en las secuencias de codificación y se conocen como los codones raros. Sus traducciones en aminoácidos se basan en los tRNAs cognados que llevan los aminoácidos correspondientes. Sin embargo, los arnms que reconocen codones raros suelen tener abundancias mucho más bajas que los arba de los codones comunes^10,11. En consecuencia, estos raros tRNAs son menos propensos a capturar los aminoácidos libres en las competiciones con otros isoaceptadores, y las traducciones de las secuencias ricas en codón raro comienzan a desacelerar se o incluso se terminan cuando las cantidades de aminoácidos son limitadas ¹⁰. Las traducciones podrían, teóricamente, restaurarse si hay un excedente de aminoácidos después de cargar los TRNA comunes sinónimos debido a sobreproducciones o alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes¹². Si el gen rico en codón raro codifica un marcador de selección o cribado, las cepas que presentan los fenotipos correspondientes pueden identificarse fácilmente y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos.

La estrategia anterior se aplica para establecer una selección y un sistema de cribado para la identificación de los sobreproductores de aminoácidos. El sistema de selección utiliza genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kan^R) como marcadores, mientras que el sistema de cribado utiliza los genes que codifican las proteínas fluorescentes fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes [GFP]) o cromogénicas (por ejemplo, PrancerPurple). Los genes marcadores en ambos sistemas se modifican reemplazando los números definidos de los codones comunes para el aminoácido dirigido por su rara alternativa sinónima. Las cepas de la biblioteca de mutaciones que albergan el gen marcador rico en codón raro se seleccionan o examinan en condiciones adecuadas, y los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos pueden ser fácilmente identificados. El flujo de trabajo comienza con la construcción del sistema genético marcador rico en codón poco raro, seguido de la optimización de las condiciones de trabajo, y luego la identificación y verificación de los aminoácidos sobreproductores. Esta estrategia independiente del análogo se basa en el dogma en la traducción de proteínas y se ha verificado prácticamente para permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Teóricamente, podría emplearse directamente a aminoácidos con codones raros y a todos los microorganismos. En total, la estrategia basada en codón raro servirá como una alternativa eficiente al enfoque convencional basado en analógico cuando los análogos adecuados para aminoácidos específicos no están disponibles, o cuando una alta tasa de falsos positivos es la principal preocupación. El siguiente protocolo utiliza leucina rara codón para demostrar esta estrategia en la identificación de los sobreproductores de Escherichia coli L-leucina.

Protocol

1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido.NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kanR, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección13. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codon…

Representative Results

Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de600 OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD600 celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de cod…

Discussion

El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresione…

Materials

Acetonitrile	Thermo	51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit	Transgen	EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	Transgen	EG101-01
Gibson assembly master mix	NEB	E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio	I8070
L-leucine	Sigma	L8000
Microplate reader	Biotek	Synergy 2
n-hexane	Thermo	H3061
Phenyl isothiocyanate	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase	Transgen	AP231-01
Triethylamine	Sigma	T0886
Ultra-high performance liquid chromatography	Agilent	1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli competent cell	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column	Agilent	959759-902K