Een oncogene hepatocyte-geïnduceerde Orthotopic muis model van hepatocellulaire kanker ontstaan in de setting van leverontsteking en fibrose

Summary

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een klinisch relevant muriene model van leverkanker die de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) recapituleren.

Abstract

De afwezigheid van een klinisch relevant diermodel dat de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) aanpakt, heeft de verheldering van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën aanzienlijk belemmerd. Om een ideaal diermodel te ontwikkelen dat het humaan HCC samenvoert, krijgen immunocompetente mannelijke C57BL/6J-muizen eerst een koolstoftetrachloride (CCl₄)-injectie om leverfibrose te induceren, waarna ze histologisch-normale oncogene hepatocyten van jonge mannen krijgen SV40 T antigeen (TAg)-transgene muizen (MTD2) door intra-splenic (ISPL) inoculatie. Androgeen gegenereerd in de ontvangende mannelijke muizen in de puberteit initieert TAg expressie onder controle van een lever-specifieke promotor. Als gevolg daarvan, de overgedragen hepatocyten worden kankercellen en vorm tumor massa’s in de setting van leverfibrose/cirrose. Dit nieuwe model bootst Human HCC initiatie en progressie na in de context van leverfibrose/cirrose en weerspiegelt de meest typische kenmerken van humaan HCC inclusief immuun disfunctie.

Introduction

Hepatocellulaire kanker (HCC) is de snelst groeiende vorm van kanker in de Verenigde Staten (VS)^1,2,3. Elk jaar worden ongeveer 850.000 nieuwe gevallen gediagnosticeerd^4,5 en 700.000 patiënten sterven aan deze dodelijke ziekte^6,7,8,9,10 , waardoor het de op één na hoogste oorzaak van kanker-gerelateerde dood wereldwijd. Het beheer van HCC omvat chirurgische resectie, transplantatie, ablatie, chemoembolisatie of systemische therapieën, zoals sorafenib¹¹. Vroegtijdige diagnose en behandeling met chirurgische resectie of transplantatie hebben het hoogste totale overlevingsvoordeel⁴. Helaas, de meerderheid van de patiënten aanwezig in een later stadium en vereisen Management met ablatie, chemoembolisatie of sorafenib¹². Sorafenib, een receptor tyrosine kinase remmer (rtki), werd goedgekeurd door de Food and Drug Administration in 2008 als de enige systemische medicamenteuze therapie beschikbaar voor de behandeling van inoperabel HCC. Hoewel het medicijn alleen een bescheiden toename van de totale overleving biedt, van 7,9 tot 10,7 maanden¹³, voorzag het in een nieuwe therapeutische strategie die kon worden gebruikt om HCC te beheren.

Het manipuleren van het immuunsysteem om gevestigde kankers te elimineren is een snel groeiend veld in kankeronderzoek¹⁴. Immuun Checkpoint studies hebben aanzienlijk geavanceerde immunotherapeutische drug ontwikkeling in de behandeling van kanker^15,16. De FDA keurde het gebruik van antilichamen (ABS) goed tegen cytotoxisch T-lymfocyten antigeen 4 (CTLA-4), geprogrammeerde celdood proteïne 1 (PD-1), en zijn ligand PD-L1 voor de behandeling van melanoom, longkanker, hoofd-en nekkanker, en blaaskanker^{17, 18 , 19 , 20}. klinische studies met monotherapie-of combinatietherapie waarbij gebruik wordt gemaakt van één of meerdere antilichamen tegen pd-1, PD-L1 of ctla-4 voor de behandeling van Advanced HCC zijn aan de gang^21,22,23, en sommige proeven hebben gunstige resultaten opgeleverd. In 2017, de FDA verleende versnelde goedkeuring voor anti-PD-1 antilichaam voor de behandeling van HCC patiënten, die resistentie tegen sorafenib zijn, maar de totale responspercentage van deze therapie is slechts 14,3%. Andere strategieën zijn niet vertaald in de klinische praktijk op dit moment^24,25. Overwinnen van tumor-geïnduceerde diepgaande immuun tolerantie ter verbetering van immune Checkpoint therapie²⁶; voorspellen van de werkzaamheid van immuuncontrolepunt therapie; preventie van immuungerelateerde ongewenste voorvallen; het optimaliseren van de toedieningsroute, dosering en frequentie; en het vinden van effectieve combinaties van therapieën^27,28,29 blijven allemaal uiterst uitdagende taken.

Er zijn verschillende conventionele benaderingen gebruikt voor het induceren van HCC in muismodellen momenteel en worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeker specifieke onderzoek vraag³⁰. Chemisch geïnduceerde HCC-Muismodellen met genotoxische verbindingen bootsen letsel geïnduceerde maligniteit na. Xenograft-modellen via ectopische of orthotopic implantatie van HCC-cellijnen zijn geschikt voor geneesmiddelen screening. Een aantal genetisch gemodificeerde muizen is ontwikkeld om de pathofysiologie van HCC te onderzoeken. Transgene muizen die virale genen, oncogenen en/of groeifactoren uitdrukken, maken de identificatie mogelijk van trajecten die betrokken zijn bij hepatocarcinogenese. Vanwege inherente beperkingen, deze modellen niet recapituleren de typische immuunkenmerken gezien in humaan HCC, die aanzienlijk heeft belemmerd verheldering van de onderliggende mechanismen en ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën^{14 ,15}. Onlangs hebben we een klinisch relevant Murine model gecreëerd. Dit nieuwe model bootst niet alleen menselijke HCC initiatie en progressie na, maar weerspiegelt ook de meest typische kenmerken van menselijke ziekte, waaronder immuun disfunctie. We hebben de biologische en immunologische kenmerken ervan gekenmerkt. Gebruikmakend van dit nieuwe model hebben we verschillende immunotherapeutische strategieën onderzocht voor de behandeling van HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. dit unieke platform stelt ons in staat om mechanismen van tumor-geïnduceerde immunotolerance te bestuderen en om proof-of-concept therapeutische strategieën te ontwikkelen voor HCC naar uiteindelijke klinische vertaling.

Protocol

Opmerking: alle procedures inclusief dierproef personen zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Universiteit van Missouri. Alle muizen kregen humane verzorging volgens de criteria die zijn uiteengezet in de “gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren”. De volgende procedure voor celisolatie en inoculatie moet worden uitgevoerd in een afzuigkap. Alle performers moeten de standaard persoonlijke beschermingsmiddelen dragen voor het hanteren van de muizen en weefsels. 1. inductie van lever…

Representative Results

Oncogene hepatocyten die zijn geïsoleerd van TAg-transgene muizen (Figuur 2) werden in de lever van wild type muizen geënt door intra-milt injectie (Figuur 3). De getransplanteerde hepatocyten succesvol en betrouwbaar groeide orthotopic HCC tumoren (Figuur 4) met tumor specifieke antigeen SV40 TAg (Figuur 5) in de setting van hepatische ontsteking en fibrose (Figuur 1). <img …

Discussion

Met dit protocol hebben we een betrouwbaar en reproduceerbaar muriene model van HCC opgezet dat menselijke HCC initiatie en progressie nabootst. Klinisch, veel risicofactoren achtereenvolgens induceren leverletsel, leverfibrose, cirrose en de laatste fase van HCC. In ons protocol wordt IP-injectie van CCl₄ gebruikt om eerst leverfibrose te produceren in wild type muizen, waardoor de daaropvolgende oncogene hepatocyten de tumoren vormen in de setting van leverfibrose. We ontdekten dat tumorvorming het meest suc…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close