Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

Summary

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Abstract

Das Fehlen eines klinisch relevanten Tiermodells, das sich mit den typischen Immunmerkmalen von hepatozellulärem Krebs (HCC) befasst, hat die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert. Um ein ideales Tiermodell zu entwickeln, das menschliche HCC rekapituliert, erhalten immunkompetente männliche C57BL/6J-Mäuse zunächst eine Tetrachlorsäure-Injektion (CCl₄), um Leberfibrose zu induzieren, und erhalten dann histologisch-normale onkogene Hepatozyten von jungen SV40 T Antigen (TAg)-transgene Mäuse (MTD2) durch intrasplenische (ISPL) Inokulation. Androgen erzeugt in Empfänger männlichen Mäusen in der Pubertät initiiert TAg-Expression unter Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotor. Dadurch werden die übertragenen Hepatozyten zu Krebszellen und bilden Tumormassen bei der Einstellung von Leberfibrose/Zirrhose. Dieses neuartige Modell imitiert die Initiierung und Progression des menschlichen HCC im Kontext von Leberfibrose/Zirrhose und spiegelt die typischsten Merkmale des menschlichen HCC einschließlich Immunfunktionsstörungen wider.

Introduction

Hepatozellulärer Krebs (HCC) ist die am schnellsten zunehmende Krebsart in den Vereinigten Staaten (US)^1,2,3. Jedes Jahr werden ca. 850.000 neue Fälle diagnostiziert^4,5 und 700.000 Patienten sterben an dieser tödlichen Krankheit^6,7,8,9,10 und ist damit weltweit die zweithäufigste Todesursache im Zusammenhang mit Krebs. Die Verwaltung von HCC umfasst chirurgische Resektion, Transplantation, Ablation, Chemoembolisierung oder systemische Therapien, wie Sorafenib¹¹. Früherkennung und Management mit chirurgischer Resektion oder Transplantation haben den höchsten Gesamtüberlebensvorteil⁴. Leider, die Mehrheit der Patienten in einem späteren Stadium anwesend und erfordern Management mit Ablation, Chemoembolisierung oder Sorafenib¹². Sorafenib, ein Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (RTKI), wurde von der Food and Drug Administration im Jahr 2008 als einzige systemische medikamentöse Therapie zur Behandlung von nicht resezierbaren HCC zugelassen. Obwohl das Medikament nur eine bescheidene Erhöhung des Gesamtüberlebens bietet, von 7,9 auf 10,7 Monate¹³, es bot eine neue therapeutische Strategie, die verwendet werden könnte, um HCC zu verwalten.

Die Manipulation des Immunsystems zur Beseitigung etablierter Krebsarten ist ein schnell wachsendes Feld in der Krebsforschung¹⁴. Immun-Checkpoint-Studien haben erheblich fortgeschrittene immuntherapeutische Arzneimittelentwicklung in der Krebsbehandlung^15,16. Die FDA genehmigte die Verwendung von Antikörpern (Abs) gegen zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), programmiertes Zelltodprotein 1 (PD-1) und seinen Liganden PD-L1 zur Behandlung von Melanom, Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Blasenkrebs^{17, 18 , 19 , 20}. Klinische Studien zur Monotherapie oder Kombinationstherapie mit einem oder mehreren Antikörpern gegen PD-1, PD-L1 oder CTLA-4 zur Behandlung fortgeschrittener HCC sind im Gange^21,22,23und einige Studien haben positive Ergebnisse gezeigt. Im Jahr 2017 erteilte die FDA eine beschleunigte Zulassung für Anti-PD-1-Antikörper zur Behandlung von HCC-Patienten, die gegen Sorafenib resistenzen, aber die Gesamtansprechrate dieser Therapie beträgt nur 14,3%. Andere Strategien wurden zu diesem Zeitpunkt nicht in die klinische Praxis übersetzt^24,25. Überwindung der tumorinduzierten tiefen Immuntoleranz zur Verbesserung der Immun-Checkpoint-Therapie²⁶; Vorhersage der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Therapie; Immunbedingte Nebenwirkungen zu verhindern; Optimierung der Verabreichung S-Route, Dosierung, und Häufigkeit; und die Suche nach effektiven Kombinationen der Therapien^27,28,29 bleiben alle extrem herausfordernde Aufgaben.

Es gibt mehrere konventionelle Ansätze, die verwendet werden, um HCC in Mausmodellen zu induzieren und werden in Abhängigkeit von der speziellen Forschungsfrage des Forschers^{verwendet 30}. Chemisch induzierte HCC-Mausmodelle mit genotoxischen Verbindungen imitieren verletzungsinduzierte Malignität. Xenograft-Modelle durch ektopische oder orthotopische Implantation von HCC-Zelllinien eignen sich für das Arzneimittelscreening. Eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von HCC zu untersuchen. Transgene Mäuse, die virale Gene, Onkogene und/oder Wachstumsfaktoren exdrücken, ermöglichen die Identifizierung von Wegen, die an der Hepatocarcinogenese beteiligt sind. Aufgrund inhärenter Einschränkungen fassen diese Modelle nicht die typischen Immuneigenschaften des menschlichen HCC zusammen, was die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert hat^{14 ,15}. Kürzlich haben wir ein klinisch relevantes murines Modell entwickelt. Dieses neuartige Modell imitiert nicht nur die Menschliche HCC-Initiierung und Progression, sondern spiegelt auch die meisten typischen Merkmale menschlicher Krankheiten wider, einschließlich Immunfunktionsstörungen. Wir haben seine biologischen und immunologischen Eigenschaften charakterisiert. Unter Der Nutzung dieses neuartigen Modells haben wir verschiedene immuntherapeutische Strategien zur Behandlung von HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Diese einzigartige Plattform ermöglicht es uns, Mechanismen der tumorinduzierten Immunverträglichkeit zu untersuchen und proof-of-Concept-Therapiestrategien für HCC für eine eventuelle klinische Translation zu entwickeln.

Protocol

HINWEIS: Das gesamte Verfahren einschließlich tierischer Probanden wurde vom IACUC an der University of Missouri genehmigt. Alle Mäuse wurden nach den Kriterien des “Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren” human gepflegt. Das folgende Verfahren zur Zellisolierung und -impfung sollte in einer Kapuze durchgeführt werden. Alle Darsteller sollten die standardmäßige persönliche Schutzausrüstung für den Umgang mit Mäusen und Gewebe tragen. 1. Induktion von Leberfibrose und …

Representative Results

Onkogene Hepatozyten, die von TAg-transgenen Mäusen isoliert wurden (Abbildung 2), wurden in der Leber von Wildtypmäusen durch intra-splenische Injektion ausgesät (Abbildung 3). Die transplantierten Hepatozyten wuchsen erfolgreich und zuverlässig orthotopische HCC-Tumoren (Abbildung 4) mit tumorspezifischem Antigen SV40 TAg (Abbildung 5) bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose ( Abbildung1). <p class="jove_content"…

Discussion

Mit diesem Protokoll haben wir ein zuverlässiges und reproduzierbares murines Modell von HCC etabliert, das die menschliche HCC-Initiierung und Progression imitiert. Klinisch, viele Risikofaktoren sukzessive induzieren Leberschäden, Leberfibrose, Zirrhose und die endk.-Phase von HCC. In unserem Protokoll wird die IP-Injektion von CCl₄ verwendet, um zuerst Leberfibrose bei Wildtypmäusen zu produzieren, was es den nachfolgenden onkogenen Hepatozyten ermöglicht, die Tumoren bei der Einstellung von Leberfibros…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close