초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석
Summary
여기에서, 우리는 비침습적이고 세부지향적인 방식으로 Drosophila 배아에서 배아 근육 수축을 기록하는 방법을 제시한다.
Abstract
조정된 근육 수축은 Drosophila 태아에 있는 발달 도중 일찌기 보인 리듬 행동의 한 형태입니다. 이 동작을 제어하려면 신경 감각 피드백 회로가 필요합니다. 수축의 리듬 패턴을 생성하지 못하면 신경 학적 이상을 나타낼 수 있습니다. 우리는 이전에 단백질 O-mannosylation에 있는 결점을, 번역 후 단백질 수정, 감각 신경의 축삭 형태에 영향을 미치고 태아에 있는 이상한 조정한 근육 수축 귀착된다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에서, 우리는 단백질의 근육 수축 표현형을 특성화하기 위하여 이용된 부화의 점까지 말기 태아의 살아있는 화상 진찰에 의하여 연동 근육 수축의 패턴을 기록하고 분석하기 위한 상대적으로 간단한 방법을 제시합니다 O-만노실 트랜스퍼라제 돌연변이체. 이 기록에서 얻은 데이터는 주파수, 전파 방향 및 다른 신체 세그먼트에서 근육 수축의 상대적 진폭을 포함하여 근육 수축 파를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 바디 자세를 검토하고 정확하게 태아 중간선의 위치를 결정하기 위하여 근육에서 구체적으로 표현된 형광 마커의 이용을 취했습니다. 유사한 접근은 또한 배아 압연 및 부화와 같은 발달 도중 각종 그밖 행동을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
연동 근육 수축은 인간 1,2,3에서걷기와 수영과 유사한 리듬 운동 동작입니다. Drosophila 후기 단계 배아에서 보인 배아 근육 수축은 그러한 행동의 예를 나타낸다. 초파리는 다양한 발달 과정을 연구하는 우수한 모델 유기체로, 초파리에서배아발달이 잘 특성화되어 있고, 상대적으로 짧고, 모니터링하기 쉽다. 우리의 방법의 전반적인 목표는 신중하게 기록하고 배아 근육의 수축과 이완의 물결 모양의 패턴을 분석하는 것입니다. 우리는 근육 수축의 상세한 시각화, 기록 및 분석을 제공하는 간단한 비침습적 접근법을 사용했습니다. 이 방법은 또한 잠재적으로 부화 직전에 말기 배아에서 보인 배아 압연과 같은 생체 내 다른 과정을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이전 연구에서, 배아 근육 수축은 주로 주파수 및방향 의 관점에서 분석되었다 1,2. 전방 또는 후방 방향으로 신체 축을 따라 진행하면서 수축의 상대적 정도를 추정하기 위해, 우리는 근육에서 GFP를 구체적으로 발현하는 배아를 사용했습니다. 이 분석은 근육 수축을 분석하고 근육 수축의 연동 파의 일련의 동안 배아의 신체 자세가 어떻게 유지되는지를 밝히는 보다 정량적인 방법을 제공합니다.
연동 근육 수축은 중앙 패턴 발생기 (CPG) 회로 및 말초 신경계 (PNS), 중추 신경계 (CNS) 및 근육4,5의뉴런 간의 통신에 의해 제어됩니다. 정상적인 연동 근육 수축을 생성하지 못하면 부화 실패2 및 비정상적인 애벌레 운동 6과 같은 결함이 발생할 수 있으며 신경 학적 이상을 나타낼 수 있습니다. 근육 수축의 연동 파의 살아있는 화상 진찰 및 수축 표현형의 상세한 분석은 운동에 관련되었던 근육 및 신경 회로에 영향을 미치는 유전 적 결함과 관련되었던 병원성 기계장치를 밝히는 것을 도울 수 있습니다. 우리는 최근에 p로테인 O-m annosyltransferase (POMT) 돌연변이체의 신체 자세비틀림 표현형을 초래하는 메커니즘을 조사하기 위해 이러한 접근법을 사용했다.
단백질 O-만노실화(POM)는 분비 통로 단백질의 세린 또는 쓰레오닌 잔류물8,9에만노스 슈가를 첨가하는 특별한 유형의 번역 후 변형이다. POM에 있는 유전 적 결함은 인간에 있는 선천성 근육 dys트로피 (CMD)를 일으키는 원인이 됩니다10,11,12. 우리는 모형 시스템으로 Drosophila를 사용하여 이 질병의 원인 기계장치를 조사했습니다. 우리는 Drosophila 단백질 O-mannosyltransferase 유전자 POMT1 및 POMT2 (일명 회전 복부 (rt)와 꼬인 (tw)에 있는 돌연변이를 가진 배아가 보여준다는 것을 것을을 발견했습니다 신체 세그먼트의 변위(“회전”)로 인해 비정상적인 신체자세가7. 흥미롭게도, 이 결함은 연동 근육 수축이 눈에 띄는 될 때 개발 단계와 일치7.
POM 돌연변이 배아의 비정상적인 신체 자세는 근육과 표피가 이미 형성되고 조정된 근육 수축의 연동파가 시작될 때 발생하기 때문에 비정상적인 신체 자세가 비정상적인 근육의 결과일 수 있다고 가정했습니다. 근육 또는 표피 형태에 결함이 아닌 수축7. CMDs는 이상한 근육 수축 및 자세 결점13와연관될 수 있고, 따라서 Drosophila POMT 돌연변이체에 있는 자세 표현형의 분석은 근이영양증과 관련되었던 병리학적인 기계장치를 해명할 수 있습니다 . Drosophila POMT 돌연변이체의 신체 자세 표현형과 근육 수축의 연동 파에서 가능한 이상 사이의 관계를 조사하기 위해, 우리는 살아있는 을 사용하여 근육 수축을 자세히 분석하기로 결정했습니다. 이미징 접근 방식.
Drosophila 태아에 있는 연동 수축 파의 우리의 분석은 타입-1과 타입-2 파파로 지정된 2개의 명백한 수축 모드를, 밝혔습니다. 타입 1 파도는 전방에서 후방으로 전파되는 단순한 파도이거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 유형 2 파도는 전방 끝에서 시작, 후방 방향으로 중간 전파, 순간적으로 정지, 시간 정적 수축을 형성하고, 두 번째 단계 동안, 전파 연동 수축에 의해 휩쓸된다 이파성 파도입니다 뒤쪽 끝에서 앞으로. 야생 형 배아는 일반적으로 대략 75% 타입-1 및 25% 타입 2 파파로 이루어져 있는 수축의 시리즈를 생성합니다. 대조적으로, POMT 돌연변이 배아는 대략 동등한 상대 주파수에서 타입-1 및 타입-2 파형을 생성합니다.
우리의 접근은 근육 수축 및 배아 압연7의 정량분석을 위한 상세한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 접근은 또한 해치와 크롤링과 같은 근육 수축을 관련시키는 그밖 행동의 분석을 위해 적응될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 방법은 파도 주기성, 진폭 및 패턴을 포함하여 연동 근육 수축 파뿐만 아니라 배아 압연 및 자세에 대한 파 효과와 같은 발달 중에 중요한 배아 행동을 분석하는 정량적 방법을 제공합니다. 이것은 배아 발달 도중 이들과 그밖 행동을 통제에 있는 특정 유전자의 역할을 공부하기 위하여 다른 돌연변이의 분석에서 유용할 수 있습니다. 우리는 근육 수축 진폭, 빈도 및 배아의 수축 파 전파 방…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 국립 보건 원RO1 NS099409, NS075534 및 CONACYT 2012-037 (S)에서 부사장에게 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referenzen
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetik. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
