Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона
Summary
Здесь мы представляем метод записи эмбриональных мышечных сокращений в эмбрионах Дрозофилы в неинвазивной и подробно-ориентированной манере.
Abstract
Скоординированные сокращения мышц являются одной из форм ритмического поведения видели рано во время развития в дрозофилы эмбрионов. Нейронные сенсорные цепи обратной связи необходимы для контроля такого поведения. Неспособность произвести ритмическую картину сокращений может свидетельствовать о неврологических аномалиях. Ранее мы обнаружили, что дефекты в белке O-mannosylation, постпереводной модификации белка, влияют на аксон морфологии сенсорных нейронов и привести к ненормальным скоординированных сокращений мышц в эмбрионах. Здесь мы представляем относительно простой метод для записи и анализа структуры перистальтических сокращений мышц путем живой визуализации эмбрионов поздней стадии до точки вылупления, который мы использовали для характеристики фенотипа белка сокращения мышц O-mannosyltransferase мутантов. Данные, полученные из этих записей, могут быть использованы для анализа волн сокращения мышц, включая частоту, направление распространения и относительную амплитуду мышечных сокращений на разных сегментах тела. Мы также изучили осанку тела и воспользовались флуоресцентным маркером, выраженным специально в мышцах, чтобы точно определить положение среднего эмбриона. Аналогичный подход также может быть использован для изучения различных других моделей поведения во время разработки, таких как катание эмбрионов и вылупление.
Introduction
Перистальтический сокращения мышц является ритмическое моторное поведение, аналогичное ходьбе и плаванию у людей1,2,3. Эмбриональные сокращения мышц видели в Дрозофилы поздней стадии эмбрионов представляют собой пример такого поведения. Дрозофила является отличной моделью организма для изучения различных процессов развития, потому что эмбриональное развитие в дрозофиле хорошо характеризуется, относительно короткий, и легко контролировать. Общая цель нашего метода заключается в тщательной записи и анализе волнообразных моделей сокращения и расслабления эмбриональных мышц. Мы использовали простой, неинвазивный подход, который предлагает детальную визуализацию, запись и анализ мышечных сокращений. Этот метод также может быть потенциально использован для изучения других процессов in vivo, таких как эмбриональный прокат, наблюдаемый в эмбрионах на поздних стадиях эмбрионов непосредственно перед вылуплянием. В предыдущих исследованиях, эмбриональные сокращения мышц в основном были проанализированы с точки зрения частоты и направления1,2. Для того, чтобы оценить относительную степень сокращений, как они прогрессируют вдоль оси тела в передней или задней направлении, мы использовали эмбрионы, выражающие GFP специально в мышцах. Этот анализ предоставляет более количественный способ анализа мышечных сокращений и выявить, как осанка тела в эмбрионах поддерживается во время серии перистальтических волн мышечных сокращений.
Перистальтические сокращения мышц контролируются центральным генератором шаблона (CPG) схемами и связи между нейронами периферической нервной системы (PNS), центральной нервной системы (ЦНС), и мышц 4,5. Неспособность производить нормальные перистальтические сокращения мышц может привести к дефектам, таким как неспособность люк2 и ненормальные личиночного движения6 и может свидетельствовать о неврологических аномалий. Live изображения перистальтических волн сокращения мышц и подробный анализ фенотипов сокращения может помочь выявить патогенные механизмы, связанные с генетическими дефектами, влияющими на мышцы и нейронные цепи, участвующие в передвижении. Недавно мы использовали этот подход для исследования механизмов, которые приводят к осаде тела торсионфеи фенотипа protein O–mannosyltransferase (POMT) мутантов7.
Белок O-mannosylation (POM) является особым типом постпереводной модификации, где манноза сахар добавляется в сыворотки или трионин остатки секреторных белков пути8,9. Генетические дефекты в POM вызывают врожденные мышечные дистрофии (CMD) у людей10,11,12. Мы исследовали возбудительные механизмы этих заболеваний с использованием дрозофилы в качестве модели системы. Мы обнаружили, что эмбрионы с мутациями в протеине Drosophila O-mannosyltransferase генов POMT1 и POMT2 (также известной о вращающемся животе (rt) и витой (tw)) показывают смещение (“вращение”) сегментов тела, что приводит к аномальной осанке тела7. Интересно, что этот дефект совпал с стадией развития, когда перистальтические сокращения мышц становятся заметными7.
Поскольку аномальная осанка тела в poM мутантэмбрионов возникает, когда мускулатура и эпидермис уже сформированы и перистальтические волны скоординированных мышечных сокращений начали, мы предположили, что ненормальная осанка тела может быть результатом аномальной мышцы сокращения, а не дефект в мышцах или / и эпидермис морфологии7. CMDs может быть связано с аномальными сокращениями мышц и дефектами осанки13, и, таким образом, анализ осанки фенотипа у мутантов Drosophila POMT может выяснить патологические механизмы, связанные с мышечной дистрофией . Для того, чтобы исследовать связь между осанкой тела фенотипом мутантов Drosophila POMT и возможными отклонениями в перистальтических волнах мышечных сокращений, мы решили детально проанализировать мышечные сокращения с помощью живого подход к визуализации.
Наш анализ перистальтических волн сокращения эмбрионов Дрозофилы выявил два различных режима сокращения, обозначенных как волны типа 1 и типа 2. Тип 1 волны простые волны, распространяющиеся от передней до задней или наоборот. Тип 2 волны двухфазных волн, которые инициируют на передней части, размножаются на полпути в задней направлении, на мгновение остановить, образуя временное статическое сокращение, а затем, во время второй фазы, прокатилась перистальтического сокращения, которое распространяется вперед от заднего конца. Эмбрионы дикого типа обычно генерируют серию сокращений, которая состоит примерно из 75% волн типа 1 и 25%. В отличие от этого, эмбрионы мутантов POMT генерируют волны типа 1 и типа 2 на примерно равных относительных частотах.
Наш подход может предоставить подробную информацию для количественного анализа мышечных сокращений и эмбриона прокатки7. Этот подход может быть также адаптирован для анализа других моделей поведения, связанных с мышечными сокращениями, таких как вылупление и ползание.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш метод обеспечивает количественный способ анализа важных поведения эмбрионов во время развития, таких как перистальтические волны сокращения мышц, включая периодичность волн, амплитуду и рисунок, а также волновое воздействие на подвижность эмбриона и осанку. Это может быть полезн?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения гранты RO1 NS099409, NS075534, и CONACYT 2012-037 (S) в Вице-президент.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referenzen
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetik. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
