Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive l’isolamento e la coltura di espiante cartilaginee dalle ginocchia bovine. Questo metodo fornisce uno strumento facile e accessibile per descrivere i cambiamenti dei tessuti in risposta a stimoli biologici o nuove terapie mirati all’articolazione.
Abstract
I sistemi di coltura Ex vivo coprono un’ampia gamma di esperimenti dedicati allo studio della funzione cellulare e dei tessuti in un ambiente nativo. La cartilagine è un tessuto unico importante per il corretto funzionamento dell’articolazione sinoviale ed è costituito da una densa matrice extracellulare (ECM), ricca di collagene proteoglicano e di tipo II. I condrociti sono l’unico tipo di cellula presente all’interno della cartilagine e sono diffusi e relativamente bassi nel numero. Gli stimoli esterni alterati e la segnalazione cellulare possono portare a cambiamenti nella composizione e nel deterioramento dell’ECM, che sono importanti segni patologici in malattie come l’osteoartrite (OA) e l’artrite reumatoide.
I modelli di cartilagine Ex vivo consentono la profilazione di 1) di alterazioni mediate da condrociti del turnover del tessuto cartilagineo, 2) visualizzando la composizione ECM della cartilagine e 3) riarrangiamento dei condrociti direttamente nel tessuto. La profilazione di queste alterazioni in risposta a stimoli o trattamenti è di grande importanza in vari aspetti della biologia della cartilagine e completa gli esperimenti in vitro in condrociti isolati, o modelli più complessi in animali vivi in cui le condizioni sperimentali sono più difficili da controllare.
Gli esepanti della cartilagine presentano un metodo traslazionale e facilmente accessibile per valutare il rimodellamento dei tessuti nella cartilagine ECM in ambienti controllabili. Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare gli esoti della cartilagine bovina viva. Il metodo utilizza tessuto dal ginocchio bovino, che è facilmente accessibile dalla macelleria locale. Sia gli espianti che il mezzo di coltura condizionata possono essere analizzati per studiare il turnover dei tessuti, la composizione ECM e la funzione di condrocite, profilando così la modulazione ECM.
Introduction
I condrociti producono e mantengono la matrice della cartilagine. Per studiare la biologia dei condrociti e come loro e l’ECM circostante reagiscono a stimoli esterni, è fondamentale interrogarli nel loro ambiente nativo1,2. Lo studio del turnover dei tessuti cartilanei è importante per aumentare la comprensione dei meccanismi sottostanti nelle malattie articolari come l’OA, una malattia per la quale attualmente non esiste un trattamento che modifichi la malattia. Di conseguenza, vi è una notevole necessità di migliori modelli di traduzione2.
La caratterizzazione ex vivo degli effetti cellulari e tissutali è essenziale per completare altri modelli preclinici, sia in vitro, come le colture di motrice condrociti, sia in vivo, come i modelli oA indotti da interventi chirurgici o il modello di artrite autoimmune al collagene (CIA ). Numerosi studi hanno evidenziato le differenze tra il modo in cui le cellule si comportano nelle colture di monostrato 2D e nelle strutture 3D o nel loro tessuto nativo3,4. Molte cellule negli strati 2D adottano morfologie innaturali, comprese le differenze nella polarità cellulare e nell’attaccamento dei tessuti, con conseguenti differenze visive e funzionali nelle cellule all’interno dei tessuti nativi5. Le differenze sono evidenti anche nella funzionalità delle cellule, che possono spostare l’espressione proteica, portando a modelli di differenziazione profondamente alterati, macchinari regolatori e funzionalità cellulare5,6,7 ,8.
La cartilagine ECM consiste principalmente di collagene di tipo II che fornisce un quadro a matrice, e aggrecan, un proteoglicano che aiuta a trattenere il fluido all’interno del tessuto. Altre molecole matriciali come collagene di tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteina oligomericica cartilaginea (COMP), biglycan, decorin e perlecan sono presenti anche9.
Mentre l’eziologia dell’OA rimane poco chiara10,11, l’insorgenza della malattia si crede di essere causato da squilibri nel turnover dei tessuti e processi di riparazione12,13. La degradazione della cartilagine articolare è un segno distintivo di OA. I condrociti residenti nella cartilagine o le cellule nei tessuti circostanti aumentano il loro rilascio di citochine, stimolando la produzione elevata di proteine come le metalloproteine a matrice (MMP) e le aggrecanasi, che aumentano la degradazione della cartilagine ECM 14.Questa degradazione si traduce nel rilascio di piccoli frammenti proteici unici chiamati neo-epitopi, che possono essere quantificati nel siero, nelle urine o nel mezzo di coltura15. Dopo la formazione e la maturazione del collagene, vengono rilasciate anche le cosiddette proframmentazioni; questi possono essere quantificati come misura della produzione di matrici16.
Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire un modello di cartilagine ex vivo per confrontare l’effetto della stimolazione e/o del trattamento farmacologico sul turnover dei tessuti ECM. Il fatturato della cartilagine è profilato misurando i biomarcatori neo-epitopi derivanti dalla matrice direttamente nel mezzo di coltura condizionata utilizzando ELISA: AGNx1 (riflettendo l’attività dell’aggrecanasi), C2M (che riflette l’attività MMP a matrice) e ProC2 (riflettendo il collagene di tipo II) formazione). I risultati possono essere verificati dalla colorazione istologica dell’ECM, che visualizza anche l’organizzazione dei condrociti nei singoli espianti. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l’effetto di nuovi trattamenti sulla funzione condrocite e sulla cartilagine turnover ECM. Una serie di studi ha utilizzato espianti della cartilagine per descrivere i processi biologici o l’effetto dell’intervento sugli espianti sfidati con citochine utilizzando approcci quantitativi istologici o immunohistochimici, mRNA, espressione proteica o proteomica2 ,17,18. Tuttavia, questi protocolli esulano dall’ambito del manoscritto corrente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato per la profilazione del ricambio dei tessuti cartilari negli espepoli della cartilagine bovina può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti di trattamento di molti tipi di farmaci, tra cui inibitori delle vie infiammatorie intracellulari, inibitori di enzimi proteolitici, o fattori di crescita anabolizzanti.
In questo protocollo sono state descritte due diverse impostazioni: un setup anabolizzante in cui gli espianti sono stati stimolati con fattore di cre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano lo staff tecnico di Nordic Bioscience per il supporto dei laboratori, nonché la Fondazione danese per la ricerca per il sostegno generale alla nostra ricerca.
Materials
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
Referenzen
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