Sığır Diz Eksbitkilerinde Kıkırdak Remodeling Ex Vivo Doku Kültür Modeli
Summary
Burada, büyükbaş dizleri kıkırdak eksültasyonunun izole edilmesi ve kültürlenmesini açıklayan bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, eklemi hedefleyen biyolojik uyaranlara veya yeni terapötiklere yanıt olarak doku değişikliklerini tanımlamak için kolay ve erişilebilir bir araç sağlar.
Abstract
Ex vivo kültür sistemleri, doğal bir ortamda doku ve hücresel fonksiyon eğitimine adanmış çok çeşitli deneyleri kapsar. Kıkırdak sinovyal eklemin düzgün çalışması için önemli benzersiz bir dokudur ve proteoglikan ve tip II kollajen açısından zengin yoğun bir ekstrasellüler matriks (ECM) tarafından oluşturulmuştur. Kondrositler kıkırdak içinde bulunan tek hücre tipidir ve yaygın ve sayıları nispeten düşüktür. Değiştirilmiş dış uyaranlar ve hücresel sinyalizasyon ECM bileşiminde değişikliklere ve bozulmaya yol açabilir, osteoartrit gibi hastalıklarda önemli patolojik özellikleri olan (OA) ve romatoid artrit.
Ex vivo kıkırdak modelleri izin 1) kıkırdak doku ciro kondrosit aracılı değişiklikler profilleme, 2) kıkırdak ECM kompozisyongörselleştirme, ve 3) doku da doğrudan kondrosit rearrangement. Bu değişikliklerin uyaranlara veya tedavilere yanıt olarak profilleilmesi kıkırdak biyolojisinin çeşitli yönlerinde yüksek öneme sahiptir ve izole kondrositlerde in vitro deneyleri veya deneysel koşulların olduğu canlı hayvanlarda daha karmaşık modellerde in vitro deneyleri tamamlamaktadır. kontrol etmek daha zordur.
Kıkırdak eksperleri, kontrol edilebilir ortamlarda kıkırdak ECM doku remodeling değerlendirmek için bir çeviri ve kolay erişilebilir bir yöntem salar. Burada canlı büyükbaş kıkırdak ekskbitkileri izole etmek ve kültüre etmek için bir protokol uyguluyoruz. Yöntem kolayca yerel kasaplık erişilebilir sığır diz, doku kullanır. Doku cirosu, ECM bileşimi ve kondrosit fonksiyonunu araştırmak için hem ekskbitkiler hem de şartlı kültür ortamı analiz edilerek ECM modülasyonu profillenebilmiştir.
Introduction
Kondrositler kıkırdak matrisini üretir ve korurlar. Kondrositlerin biyolojisini ve onların ve çevredeki ECM’nin dış uyaranlara nasıl tepki verdiğini incelemek için, onları yerelortam1,2’desorgulamak çok önemlidir. Kıkırdak doku cirosunun incelenmesi, şu anda tedaviyi değiştiren bir hastalık bulunmayan OA gibi eklem hastalıklarında altta yatan mekanizmaların anlaşılmasını sağlamak açısından önemlidir. Sonuç olarak, daha iyi çevirimodelleri2 için önemli bir ihtiyaç vardır.
Hücre ve doku etkilerinin ex vivo karakterizasyonu kondrosit monolayer kültürler gibi in vitro, ve in vivo, cerrahi kaynaklı OA modelleri veya otoimmün kollajen kaynaklı artrit modeli (CIA) gibi diğer preklinik modelleri tamamlamak için gereklidir ). Çok sayıda çalışma hücrelerin 2D monolayer kültürlerde ve 3D yapılarda veya kendi doğal doku3,4nasıl davranışlarını arasındaki farkları vurgulamıştır. 2D tabakalardaki birçok hücre, hücre polaritesi ve doku eki farklılıkları da dahil olmak üzere doğal olmayan morfolojileri benimseyerek, doğal dokulardaki hücrelerde hem görsel hem de fonksiyonel farklılıklara yol açar5. Farklılıklar da hücrelerin işlevselliği belirgindir, hangi protein ekspresyonu kayması olabilir, derinden değişmiş farklılaşma desenleri yol, düzenleyici makine, ve hücre işlevselliği5,6,7 ,8.
Kıkırdak ECM bir matris çerçeve sağlayan tip II kollajen esas oluşur, ve aggrecan, doku içinde sıvı tutmaya yardımcı olan bir proteoglikan. Kollajen tip IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, kıkırdak oligomerik protein (COMP), biglycan, decorin ve perlecan gibi diğer matris molekülleri de mevcut9.
OA etiyolojisi belirsiz kalırken10,11, hastalığın başlangıcı doku ciro ve onarım süreçlerinde dengesizlikler neden olduğuna inanılmaktadır12,13. Eklem kıkırdağının bozulması OA’nın bir özelliğidir. Kıkırdak yerleşik kondrositler veya çevre dokularda hücreler sitokin salınımını artırmak, matris metalloproteinazlar gibi proteinlerin yüksek üretimini uyarıcı (MDP) ve aggrecanases, kıkırdak ECM bozulmasını artırmak 14. Bu bozulma, serum, idrar veya kültür ortamı15’teölçülebilen neo-epitoponlar adı verilen küçük benzersiz protein parçalarının salınımına neden olur. Kollajen oluşumu ve olgunlaşması üzerine, sözde profragments da serbest bırakılır; bu matris üretiminin bir ölçüsü olarak ölçülebilir16.
Bu protokolün amacı, stimülasyon ve/veya ilaç tedavisinin ECM doku cirosu üzerindeki etkisini karşılaştırmak için bir ex vivo kıkırdak modeli oluşturmaktır. Kıkırdak cirosu, elisa: AGNx1 (agrega aktivitesini yansıtan), C2M (matriks MMP aktivitesini yansıtan) ve ProC2 (tip II kollajeni yansıtan) kullanılarak doğrudan şartlı kültür ortamında matris kaynaklı neo-epitop biyobelirteçlerin ölçülmesiyle profillenir. oluşumu). Bulgular, ecm histolojik boyama ile doğrulanabilir, aynı zamanda bireysel ekstremite kondrosit organizasyonu görselleştirir. Açıklanan protokol kondrosit fonksiyonu ve kıkırdak ECM ciro üzerinde yeni tedavilerin etkisini test etmek için kullanılabilir. Bir dizi çalışmada, nicel histolojik veya immünhistokimyasal yaklaşımlar, mRNA, protein ekspresyonu veya proteomik ler kullanılarak biyolojik süreçleri veya müdahalenin sitokin-meydan lı ekstremiteler üzerindeki etkisini tanımlamak için kıkırdak eksplorleri kullanılmıştır2 ,17,18. Ancak, bu protokoller geçerli makalenin kapsamı dışındadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyükbaş kıkırdak ekskatörlerinde kıkırdak doku cirosunun profilini çıkarmak için burada sunulan protokol, inflamatuar hücre içi yolların inhibitörleri, inhibitörleri de dahil olmak üzere birçok ilaç çeşidinin tedavi edici etkilerinin karakterize edilmesinde kullanılabilir. proteolitik enzimler veya anabolik büyüme faktörleri.
Bu protokolde iki farklı kurulum tanımlanmıştır: eksplalerin insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ile uyarıldığı anabolik bir …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Laboratuvar desteği için Nordic Bioscience teknik personel teşekkür yanı sıra araştırma genel destek için Danimarka Araştırma Vakfı.
Materials
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
Referenzen
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care?. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?. Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).
