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Biochemie

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。

Abstract

線形mRNAに加えて、多くの真核生物遺伝子は円形RNAを生成する。ほとんどの円形RNAは、5’スプライスサイトをmRNA前mRNA内の上流3’スプライスサイトと結合することによって生成されます。この循環は、スプライス部位を近接するmRNA前の二次構造によって助けとなる可能性が高い。ヒト遺伝子では、Alu元素が豊富であり、mRNA前に反対方向に存在する場合に塩基相補性を示すため、Alu元素はこれらの二次RNA構造を促進すると考えられている。ここでは、円形RNAを形成するレポーター遺伝子を含む大きなAlu要素の生成と解析について述べる。クローニングプロトコルの最適化により、最大20kbの挿入長を持つレポーター遺伝子を生成できます。共同トランスフェクション実験での分析により、調節因子の同定が可能になります。これにより、この方法は、円形RNA形成に関与するRNA配列および細胞成分を同定することができる。

Introduction

円形のRNA
円形RNA(circRNA)は、ほとんどの生物で発現される共有閉鎖単一鎖RNAである。これらは、ダウンストリームの 5′ スプライス サイトをアップストリーム 3′ スプライス サイトに結合することによって生成されます。30-40 ntと短い相補的な塩基を示すプレmRNA中の配列は、circRNA形成2のための適切なアライメントにバックスプライス部位を持ち込む。ヒトにおいて、Alu要素1は、ゲノム3の約11%を表し、自己相補性4、5によるmRNA前に広範な二本鎖RNA構造を形成し、circRNA1の形成を促進する。

現在、circRNAの3つの主要な機能が説明されている。いくつかのcircRNAはマイクロRNA(miRNA)を結合し、隔離を通じてmiRNAスポンジ6のように作用する。CircRNAは、転写および転写後の調節に関与しており、線形スプライシング7または転写因子活性の変調との競合を通じて8.最後に、circRNAは短いオープンリーディングフレームを含み、原理研究の証明は、それらが9、10を翻訳できることを示しています。しかし、ほとんどのcircRNAの機能は謎のままです。循環RNAの大部分は、次世代シーケンシング方法11を使用して検出された。標的RT-PCR法を用いた個々の遺伝子の詳細な分析により、多数の円形RNAが未発見のまま12が発見される。

レポーター遺伝子を用い、mRNA前処理を解析
細胞にトランスフェクトされたDNAレポーター構築物由来のmRNAの分析は、円形RNAに適用できる代替プレmRNAスプライシングを研究するための確立された方法です。一般に、代替エキソン、その周囲のイントロン、および構成エキソンは、真核生物発現ベクターに増幅およびクローン化される。多くの場合、イントロンは短くされます。この構成体は真核細胞にトランスフェクトされ、通常RT-PCR13,14によって分析される。このアプローチは、共トランスフェクション実験13、15、16、17、18における規制スプライス部位とトランス作用因子をマッピングするために広く使用されています。また、タンパク質発現ミニ遺伝子の生成により、代替スプライシングを変化させる物質のスクリーニングが可能な19,20.

このメソッドは、円形のRNAに適用されています。現在、少なくとも12個のミニジーン・バックボーンが文献に記載されており、表1に要約されている。tRNAベースの発現系21,22を除き、それらはすべてポリメラーゼIIプロモーターに依存する。ここでは、円形RNAの生成に関与するシスおよびトランス作用因子を決定するヒトレポーターミニ遺伝子を生成する方法について述べる。公開されたレポーター遺伝子23の配列を用いた方法の概要を図1に示す。

Protocol

1. 構造の設計 UCSCゲノムブラウザ24を用いて、円形RNA形成に必要な反復的な要素を同定し、それらを構築物に組み込む。重要なことに、増幅用のプライマーは反復要素の外側にある必要があります。 円形RNA配列(補足図1は検査配列)をhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=startに貼り付け、?…

Representative Results

レポーター遺伝子は、円形RNA形成に影響を与える調節因子の決定を可能にする。しかし、これらのレポーター遺伝子は大きく、DNA構築を不安定にすることが多い反復的な要素を含んでいます。大きなサイズのため、エキソンを含むゲノム部分と小さな横向きのイントロニック部品を増幅することによって達成されるイントロンの一部を削除することがしばしば必要です。これらのDNA片は酵素?…

Discussion

一般に、円形RNAは、その機能と形成の研究を複雑にする1の豊富な低い存在です。リニアRNA13と同様に、レポーターミニ遺伝子を使用することで、円形RNAの形成を調節するシスおよびトランス作用因子の同定が可能となる。したがって、このアプローチは、内因性遺伝子を用いてさらに試験することができる仮説を生成する。

最も重要?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、国防総省 DoD 助成金 AZ180075 によってサポートされました。ステファン・スタムはジャクリーン・ヌーナン基金に感謝します。アンナ・パウエルは、ドイツの学術交流プログラムであるDAADの支援を受け、ジャスティン・R・ウェルデンはケンタッキー大学マックス・ステックラー賞を受賞しました。

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
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Referenzen

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Keywords: Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement
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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
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