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Biochemie

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Abstract

Además de los ARNm lineales, muchos genes eucariotas generan ARN circulares. La mayoría de los ARN circulares se generan uniendo un sitio de empalme de 5′ con un sitio de empalme ascendente de 3′ dentro de un pre-mRNA, un proceso llamado back-splicing. Esta circularización es probablemente ayudada por estructuras secundarias en el pre-mRNA que acercan los sitios de empalme. En los genes humanos, se piensa que los elementos Alu promueven estas estructuras secundarias de ARN, ya que los elementos Alu son abundantes y exhiben complementariedades de base entre sí cuando están presentes en direcciones opuestas en el pre-ARNm. Aquí, describimos la generación y el análisis de grandes elementos Alu que contienen genes de reportero que forman ARN circulares. A través de la optimización de los protocolos de clonación, se pueden generar genes de reportero con una longitud de inserción de hasta 20 kb. Su análisis en experimentos de co-transfección permite la identificación de factores regulatorios. Por lo tanto, este método puede identificar secuencias de ARN y componentes celulares involucrados en la formación de ARN circular.

Introduction

RNA circulares
Los ARN circulares (arnar circ) se cierran covalentemente en ARN de una sola trenza que se expresan en la mayoría de los organismos. Se generan uniendo un sitio de empalme descendente de 5′ a un sitio de empalme ascendente de 3′, un proceso llamado back-splicing(Figura 1A)1. Las secuencias en el pre-mRNA que exhiben base complementaria tan corta como 30-40 nt llevan los sitios de empalme hacia atrás en la alineación adecuada para la formación de ARN circn.2. En los seres humanos, los elementos Alu 1, que representan alrededor del 11% del genoma3,forman extensas estructuras de ARN de doble cadena en pre-arNM debido a su autocomplementariedad4,5 y así promueven la formación de circRNAs1.

Actualmente, se han descrito tres funciones principales de los circRNAs. Algunos círculos se unen microRNAs (miRNAs) y a través del secuestro actúan como esponjas de miRNA6. Los CircRNAs se han implicado en la regulación transcripcional y post transcripcional, a través de la competencia con el empalme lineal7 o la modulación de la actividad del factor de transcripción8. Por último, los círculos contienen marcos de lectura abiertos cortos y estudios de prueba de principio muestran que se pueden traducir9,10. Sin embargo, la función de la mayoría de los círculos narinás sigue siendo enigmática. La mayoría de los ARN circulares se han detectado utilizando métodos de secuenciación de próxima generación11. Los análisis detallados de genes individuales utilizando enfoques RT-PCR específicos revelan que un gran número de ARN circulares aún está por descubrir12.

Uso de genes reportero según el procesamiento previo al ARNm
El análisis del ARNm derivado de construcciones de reporteros de ADN transfectó en células es un método bien establecido para estudiar el empalme alternativo antes del ARNm, que se puede aplicar a los ARN circulares. En general, el exón alternativo, sus intrones circundantes y exons constitutivos se amplifican y clonan en un vector de expresión eucariota. Con frecuencia, los intrones se acortan. Las construcciones están infectadas en células eucariotas y generalmente analizadas por RT-PCR13,14. Este enfoque se ha utilizado ampliamente para mapear sitios de empalme sregulador y factores de acción trans en experimentos de co-transfección13,15,16,17,18. Además, la generación de minigenes de expresión de proteínas permitió el cribado de sustancias que cambian el empalme alternativo19,20.

El método se ha aplicado a los ARN circulares. Actualmente, al menos 12 espina dorsales de minigene se han descrito en la literatura y se resumen en la Tabla 1. Con la excepción del sistema de expresión basado en ARNm21,22, todos dependen de los promotores de la polimerasa II. Aquí, describimos un método para generar minigenes de reporteros humanos para determinar los factores cis y trans-acting involucrados en la generación de ARN circulares. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizando secuencias de un gen de reportero publicado23.

Protocol

1. Diseño de las construcciones Utilice el navegador del genomaCPSC 24 para identificar los elementos repetitivos necesarios para la formación de ARN circular e incorporarlos en las construcciones. Es importante destacar que las imprimaciones para amplificación deben estar fuera de los elementos repetitivos. Pegue la secuencia de ARN circular(Figura suplementaria 1 es una secuencia de prueba) en <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" …

Representative Results

Los genes reporteros permiten determinar factores reguladores que influyen en la formación circular de ARN. Sin embargo, estos genes reporteros son grandes y contienen elementos repetitivos que a menudo hacen que las construcciones de ADN sean inestables. Debido a su gran tamaño, a menudo es necesario eliminar partes de los intrones, lo que se logra mediante la amplificación de piezas genómicas que contienen los exons y partes intrónicas de flanqueo más pequeñas. Estas piezas de ADN se ensamblan enzimáticamente, …

Discussion

En general, los ARN circulares son de bajo abundante1, lo que complica el estudio de su función y formación. Al igual que los ARN lineales13,el uso de minigenes de reportero permite la identificación de cis y factores de acción trans que regulan la formación de ARN circulares. Por lo tanto, este enfoque genera hipótesis que se pueden probar aún más utilizando los genes endógenos.

El paso más crítico es el diseño del gen reportero. El …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la concesión AZ180075 del Departamento de Defensa. Stefan Stamm gracias Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin fue apoyada por el DAAD, programa de intercambio académico alemán, Justin R. Welden fue galardonado con el Premio de la Universidad de Kentucky Max Steckler.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
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Referenzen

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

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Keywords: Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement
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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
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