نموذج خط خلية Murine القائم على تثبيط CDK9 المزمن لدراسة عيوب الاستطالة غير الوراثية الواسعة الانتشار (TEبالتأكيد)في السرطانات
Summary
يفصّل البروتوكول نموذج سرطان المورين في المختبر لاستطالة النسخ المعيبة غير الوراثية. هنا، يستخدم تثبيط المزمن من CDK9 لقمع استطالة الإنتاجية من RNA Pol II على طول الجينات استجابة المؤيدة للالتهابات لتقليد ودراسة ظاهرة TE المفرطة سريريابالتأكيد، موجودة في حوالي 20٪ من جميع أنواع السرطان.
Abstract
لقد سبق لنا أن أبلغنا أن مجموعة فرعية من السرطانات يتم تعريفها عن طريق إلغاء اللوائح النسخية العالمية مع أوجه القصور على نطاق واسع في استطالة النسخ mRNA (TE) – ونحن ندعو مثل هذه السرطانات كما TEبالتأكيد. وتجدر الإشارة إلى أن السرطانات TEتتميز بالتأكيد بالنسخ الهامشي ومعالجة الحمض النووي الريبي الخاطئ في مجموعة كبيرة من الجينات، مثل مسارات الإنترفيرون/جاك/ستات وTNF/NF-ņB، مما يؤدي إلى قمعها. وTEبالتأكيد النوع الفرعي من الأورام في سرطان الخلايا الكلوية ومرضى الورم الميلانيني النقيلي ترتبط بشكل كبير مع ضعف الاستجابة والنتيجة في العلاج المناعي. وبالنظر إلى أهمية التحقيق في سرطان TEبالتأكيد – كما أنه ينذر بحاجز كبير ضد العلاج المناعي – والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء في المختبر TEبالتأكيد نموذج الماوس لدراسة هذه واسعة النطاق، غير وراثية التشوهات النسخية في السرطانات والحصول على رؤى جديدة، والاستخدامات الجديدة للأدوية الموجودة، أو العثور على استراتيجيات جديدة ضد مثل هذه السرطانات. نحن بالتفصيل استخدام الفلافوبيريدول المزمن بوساطة CDK9 تثبيط لإلغاء الفوسفور من بقايا سيرين 2 على C-محطة تكرار المجال (CTD) من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (RNA Pol II)، وقمع الإفراج عن RNA Pol II في النسخ المنتجة استطاله. وبالنظر إلى أن السرطانات TEبالتأكيد لا تصنف تحت أي طفرة جسدية محددة، نموذج الدوائية مفيد، وأفضل يحاكي العيوب النسخية والجينية على نطاق واسع لوحظ في نفوسهم. استخدام جرعة شبه قاتلة الأمثل من flavopiridol هو الاستراتيجية الفعالة الوحيدة في خلق نموذج قابل للتعميم من اضطراب غير وراثي على نطاق واسع في استطالة النسخ وعيوب معالجة الحمض النووي الريبي، وتقليد عن كثب TE لوحظ سريريا بالتأكيد الخصائص. ولذلك، فإن هذا النموذج من TEبالتأكيد يمكن الاستفادة من تشريح، والعوامل الخلية المستقلة تمكنهم من مقاومة هجوم الخلايا بوساطة المناعة.
Introduction
خطوة رئيسية الحد من معدل في التعبير عن جميع الجينات النشطة تقريبا هو انتقال بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (RNA Pol II) من التوقف المروج القريب إلى استطالة الإنتاجية1،2. وبالنظر إلى أن خلل التنظيم الجيني للاستطالة النسخية يساعد في تطور الأورام الخبيثة البشرية المتعددة التي تعرف بأنها TEبالتأكيد، مما يؤدي إلى إشارات دون المستوى الأمثل في مسارات الاستجابة المؤيدة للالتهابات التي تصل إلى استجابة ضعيفة والنتيجة للعلاج المناعي3، والهدف الشامل من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج مفيد في المختبر لدراسة هذه التشوهات غير الوراثية على نطاق واسع في السرطان. في ضوء ذلك، فإن استخدام التثبيط الدوائي المزمن لCDK9 هو استراتيجية فعالة لخلق نموذج قابل للتعميم من اضطراب غير وراثي على نطاق واسع في استطالة النسخ وعيوب معالجة الحمض النووي الريبي. الأساس المنطقي وراء استخدام تثبيط CDK9 المزمن هو أنه يلغي الفوسفور من بقايا سيرين 2 على C-محطة تكرار المجال (CTD) من RNA Pol II، وبالتالي قمع الإفراج عن RNA Pol II في استطالة النسخ المنتجة. أيضا، TEبالتأكيد السرطانات، التي وصفت سابقا من قبل مجموعتنا3، لا تصنف تحت أي طفرة جسدية محددة. ولذلك، فإن النموذج غير الوراثي (الدوائي) مفيد ويحاكي على أفضل وجه العيوب النسخية والجينية المنتشرة التي لوحظت فيها. الطريقة هنا تفاصيل توليد وتوصيف نموذج العلاج المزمن فلافوبيريدول من الخلايا السرطانية المورين. هذا الأسلوب يعطل بشكل واضح استطالة النسخ على طول الجينات التي تتميز أطوال الجينوم أطول، مع المروجين تستعد والتعبيرات اللاإستطيعة مثل TNF / NF-ņB والتداخل / STAT الإشارات، تسيطر عليها بعمق على مستوى استطالة النسخ3،4،5. بشكل عام، هذا النموذج الأمثل خط الخلية المورين من عيوب استطالة النسخ – النموذج الوحيد لمعلمتنا لدراسة الأورام TE وصفها حديثابالتأكيد – يدفع المقاومة للهجوم المناعي المضادة للورم، مما يجعل نظام مفيد لاستغلال و دراسة نقاط الضعف من العيوب غير الوراثية في آلات النسخ الأساسية في السرطانات في مواجهة هجوم الخلايا المناعية بوساطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ظهرت السيطرة على استطالة RNA Pol II كرافعة حاسمة لتنظيم التعبير الجيني استجابة التحفيز لصالح الخلايا الخبيثة5،7،8. التغلب على التوقف المروج القريب استطالة وإنتاج mRNA اللاحقة يتطلب نشاط كيناز من P-TEFb9،10،</su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل NCI (CA193549) وCCHMC البحوث الابتكار التجريبية جوائز لKakajan Komurov، ووزارة الدفاع (BC150484) جائزة نافيت سينغ. المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو وزارة الدفاع. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات وتحليلها، أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Referenzen
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
