A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers

Summary

Das Protokoll beschreibt ein in vitro muriner Karzinommodell der nicht-genetischen defekten Transkriptionsdehnung. Hier wird die chronische Hemmung von CDK9 verwendet, um die produktive Dehnung von RNA Pol II entlang der pro-entzündlichen Reaktionsgene zu unterdrücken, um das klinisch überversorgte^{TE-Phänomen,} das bei etwa 20% aller Krebsarten vorhanden ist, zu imitieren und zu untersuchen.

Abstract

Wir haben bereits berichtet, dass eine Teilmenge von Krebsdurchurteilen durch globale transkriptionelle Deregulierungen mit weit verbreiteten Mängeln in der mRNA-Transkriptionsdehnung (TE) definiert wird – wir nennen solche Krebsarten^definitivals TE . Insbesondere sind TE^definitiv Krebserkrankungen durch falsche Transkription und fehlerhafte mRNA-Verarbeitung in einer großen Reihe von Genen gekennzeichnet, wie Interferon/JAK/STAT und TNF/NF-B-Wege, die zu ihrer Unterdrückung führen. Der^TE-Subtyp von Tumoren bei Nierenzellkarzinom und metastasierendem Melanom korreliert signifikant mit einem schlechten Ansprechen und Ergebnis in der Immuntherapie_. Angesichts der Bedeutung der Untersuchung von TE^definitiv Krebserkrankungen – da es eine signifikante Hürde gegen Die Immuntherapie darstellt – ist das Ziel dieses Protokolls, ein In-vitro-TE-Modell zu etablieren, um diese weit verbreiteten, nicht-genetischen Transkriptionsanomalien bei Krebserkrankungen und gewinnen neue Erkenntnisse, neuartige Verwendungen für bestehende Medikamente oder neue Strategien gegen solche Krebsarten zu finden. Wir beschreiben die Verwendung von chronischer Flavopiridol-vermittelter CDK9-Hemmung zur Aufhebung der Phosphorylierung von Serin-2-Rückständen auf der C-Terminal-Repeat-Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II (RNA Pol II), wodurch die Freisetzung von RNA Pol II in die produktive Transkription unterdrückt wird. Dehnung. Da TE^definitiv krebsern ist, ist ein pharmakologisches Modell vorteilhaft und imitiert am besten die weit verbreiteten transkriptionellen und epigenetischen Defekte, die in ihnen beobachtet werden. Die Verwendung einer optimierten subletalen Dosis von Flavopiridol ist die einzige wirksame Strategie bei der Schaffung eines verallgemeinerbaren Modells nicht genetisch erweiterbarer Störungen bei der Transkriptionsdehnung und mRNA-Verarbeitungsfehlern, die die klinisch beobachteten TE genau nachahmen. ^{auf jeden Fall} Eigenschaften. Daher kann dieses Modell von TE^definitiv genutzt werden, um zellautonome Faktoren zu sezieren, die es ihnen ermöglichen, immunvermittelten Zellangriffen zu widerstehen.

Introduction

Ein wichtiger schritt zur Begrenzung der Rate bei der Expression fast aller aktiven Gene ist der Übergang der RNA-Polymerase II (RNA Pol II) von der Promotor-proximale Pausierung zur produktiven Dehnung^1,2. Angesichts der Tatsache, dass epigenetische Dysregulation der Transkriptionsdehnung hilft bei der Progression von mehreren menschlichen Malignitäten definiert als TE^definitiv, was zu suboptimalen Signalisierung in den pro-flamme Reaktionsbahnen in Höhe einer schlechten Reaktion und Ergebnis der Immuntherapie³ist das übergeordnete Ziel dieses Protokolls, ein nützliches In-v....

Protocol

Der Institutional Animal Care and Use Committee und der Institutional Biosafety Committee der Cincinnati Children es Research Foundation genehmigten alle tierexperimentellen Verfahren (IACUC-Protokoll #2017-0061 und IBC-Protokoll #IBC2016-0016), und diese Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den ImnI-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Standards durchgeführt.

1. Chronische Hemmung von RNA Pol II durch Flavopiridol-Behandlung – Basisstrategie

1. Samen B16/F10 Mausmelanom-Zellen in geringer Dichte (0,2 x 10⁶) in einer 10 cm Kulturplatte in ihrem entsprechenden Medium (Dulbecco es Modif....

Results

Hier stellen wir ein detailliertes Schema (Abbildung 1) zur Verfügung, um ein^{TE-Zellmodell} zu erstellen, das durch chronische subtödliche Behandlung(Abbildung 2) mit Flavopiridol bei 25 nM erhalten wurde. In Abbildung 3zeigen B16 OVA-Zellen an 3 Tagen behandlung mit Flavopiridol teilweise Merkmale von^TE, aber nach einer Woche Behandlung zeigen B16/F10 OVA-Zellen einen tiefen Ver.......

Discussion

Die RNA Pol II Dehnungskontrolle hat sich als entscheidender Hebel für die Regulierung der stimulusresponsiven Genexpression zugunsten bösartiger Zellen^5,7,8herauskristallisiert. Die Überwindung der promotor-proximalen Pausation bis zur Dehnung und der anschließenden mRNA-Produktion erfordert die Kinase-Aktivität von P-TEFb^9,10,11. Unse.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12-Well-Platten	Falcon	353043
20 % Methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-Well-Platten	Falcon	351147
4 18 % SDS-Polyacrylamid-Gel	Bio-Rad	4561086
4 % Paraformaldehyd	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5 % Trockenmilch	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosin-Antikörper	BioVision	6655-30T 96-Well-Platten
	Cellstar	655180
AF647-konjugierte Maus CD8	Biolegend
Antibiotikum und Antimykotikum	Gibco	15240-062
Anti-His-Antikörper	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit-Zellsignalisierung		7074	Verdünnung 1:5000
		7077S	Verdünnung 1:5000
Bradford-Assay-Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-konjugierte Maus CD45	Biolegend	109831
Kristallviolett	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixierbarer Lebend-/Totfärbefarbstoff e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Verdünnung 1:2000
IFN-α	Forschung & Forschung D systems	12100-1
IFN-& gamma	Forschung & Forschung D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemilumineszenz HRP Substrat	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Maus CD8 T-Zell-Isolationskit	Biolegend	480007
NF-κ	B-Zell-Signalweg	8242s	Verdünnung 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κ	B-Zell-Signalisierung	3033s	Verdünnung 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Aktives Motiv	61083	Verdünnung 1:500
p-Ser5-RNAPII	Aktives Motiv	61085	Verdünnung 1:1000
p-STAT1	Zellsignalisierung	7649s	Verdünnung 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA Puffer	Santa Cruz Biotechnologie	sc-24948
RNAPII	Aktives Motiv	61667	Verdünnung 1:1000
STAT1	Zellsignalisierung	9175s	Verdünnung 1:1000
TNF-α	Forschung & Forschung D-Systeme	410-MT-010
gesamt H3-Zellsignalisierung		4499	Verdünnung 1:2000
Trireagenz	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Aktinzellsignalisierung		12620S	Verdünnung 1:5000
β-ME	G Biowissenschaften	BC98