Das Protokoll beschreibt ein in vitro muriner Karzinommodell der nicht-genetischen defekten Transkriptionsdehnung. Hier wird die chronische Hemmung von CDK9 verwendet, um die produktive Dehnung von RNA Pol II entlang der pro-entzündlichen Reaktionsgene zu unterdrücken, um das klinisch überversorgteTE-Phänomen, das bei etwa 20% aller Krebsarten vorhanden ist, zu imitieren und zu untersuchen.
Wir haben bereits berichtet, dass eine Teilmenge von Krebsdurchurteilen durch globale transkriptionelle Deregulierungen mit weit verbreiteten Mängeln in der mRNA-Transkriptionsdehnung (TE) definiert wird – wir nennen solche Krebsartendefinitivals TE . Insbesondere sind TEdefinitiv Krebserkrankungen durch falsche Transkription und fehlerhafte mRNA-Verarbeitung in einer großen Reihe von Genen gekennzeichnet, wie Interferon/JAK/STAT und TNF/NF-B-Wege, die zu ihrer Unterdrückung führen. DerTE-Subtyp von Tumoren bei Nierenzellkarzinom und metastasierendem Melanom korreliert signifikant mit einem schlechten Ansprechen und Ergebnis in der Immuntherapie. Angesichts der Bedeutung der Untersuchung von TEdefinitiv Krebserkrankungen – da es eine signifikante Hürde gegen Die Immuntherapie darstellt – ist das Ziel dieses Protokolls, ein In-vitro-TE-Modell zu etablieren, um diese weit verbreiteten, nicht-genetischen Transkriptionsanomalien bei Krebserkrankungen und gewinnen neue Erkenntnisse, neuartige Verwendungen für bestehende Medikamente oder neue Strategien gegen solche Krebsarten zu finden. Wir beschreiben die Verwendung von chronischer Flavopiridol-vermittelter CDK9-Hemmung zur Aufhebung der Phosphorylierung von Serin-2-Rückständen auf der C-Terminal-Repeat-Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II (RNA Pol II), wodurch die Freisetzung von RNA Pol II in die produktive Transkription unterdrückt wird. Dehnung. Da TEdefinitiv krebsern ist, ist ein pharmakologisches Modell vorteilhaft und imitiert am besten die weit verbreiteten transkriptionellen und epigenetischen Defekte, die in ihnen beobachtet werden. Die Verwendung einer optimierten subletalen Dosis von Flavopiridol ist die einzige wirksame Strategie bei der Schaffung eines verallgemeinerbaren Modells nicht genetisch erweiterbarer Störungen bei der Transkriptionsdehnung und mRNA-Verarbeitungsfehlern, die die klinisch beobachteten TE genau nachahmen. auf jeden Fall Eigenschaften. Daher kann dieses Modell von TEdefinitiv genutzt werden, um zellautonome Faktoren zu sezieren, die es ihnen ermöglichen, immunvermittelten Zellangriffen zu widerstehen.
Ein wichtiger schritt zur Begrenzung der Rate bei der Expression fast aller aktiven Gene ist der Übergang der RNA-Polymerase II (RNA Pol II) von der Promotor-proximale Pausierung zur produktiven Dehnung1,2. Angesichts der Tatsache, dass epigenetische Dysregulation der Transkriptionsdehnung hilft bei der Progression von mehreren menschlichen Malignitäten definiert als TEdefinitiv, was zu suboptimalen Signalisierung in den pro-flamme Reaktionsbahnen in Höhe einer schlechten Reaktion und Ergebnis der Immuntherapie3ist das übergeordnete Ziel dieses Protokolls, ein nützliches In-vitro-Modell zu etablieren, um diese weit verbreiteten nicht-genetischen Transkriptionsanomalien bei Krebserkrankungen zu untersuchen. Vor diesem Hintergrund ist die Anwendung der chronischen pharmakologischen Hemmung von CDK9 eine wirksame Strategie zur Schaffung eines verallgemeinerbaren Modells nicht-genetisch erweiterbarer Störungen bei der Transkriptionsdehnung und mRNA-Verarbeitungsfehlern. Der Grund für die Verwendung der chronischen CDK9-Hemmung ist, dass es die Phosphorylierung von Serin-2-Rückständen auf der C-Terminal-Repeat-Domäne (CTD) von RNA Pol II aufhebt und so die Freisetzung von RNA Pol II in produktive Transkriptiondehnung unterdrückt. Auch TEdefinitiv Krebserkrankungen, die zuvor von unserer Gruppe3beschrieben wurden, werden nicht unter eine spezifische somatische Mutation eingestuft. Daher ist ein nicht-genetisches (pharmakologisches) Modell vorteilhaft und imitiert am besten die weit verbreiteten transkriptionellen und epigenetischen Defekte, die in ihnen beobachtet wurden. Die hierin enthaltene Methode beschreibt die Generierung und Charakterisierung des chronischen Flavopiridol-Behandlungsmodells von murinen Krebszellen. Diese Methode stört nachweislich die Transkriptionsdehnung entlang von Genen, die durch längere genomische Längen gekennzeichnet sind, mit aufgesetzten Promotoren und induzierbaren Ausdrücken wie TNF/NF-B und Interferon/STAT-Signalisierung, die auf der Ebene der Transkriptionsdehnung 3,4,5. Insgesamt treibt dieses optimierte modellhafte Zelllinienmodell von Transkriptionsdehnungsdefekten – das einzige Modell, das nach unserem Wissen die neu beschriebenenTE-Tumoren untersucht – die Resistenz gegen Anti-Tumor-Immunangriffe und macht ein nützliches System zur Ausnutzung und untersuchen Sie die Schwachstellen nichtgenetischer Defekte in Kerntranskriptionsmaschinen bei Krebserkrankungen gegenüber immunvermitteltem Zellangriff.
Die RNA Pol II Dehnungskontrolle hat sich als entscheidender Hebel für die Regulierung der stimulusresponsiven Genexpression zugunsten bösartiger Zellen5,7,8herauskristallisiert. Die Überwindung der promotor-proximalen Pausation bis zur Dehnung und der anschließenden mRNA-Produktion erfordert die Kinase-Aktivität von P-TEFb9,10,11….
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch NCI (CA193549) und CCHMC Research Innovation Pilot Awards an Kakajan Komurov und Department of Defense (BC150484) Award an Navneet Singh. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder des Department of Defense dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
12 well plates | Falcon | 353043 | |
20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
24-well plates | Falcon | 351147 | |
4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
96-well plates | Cellstar | 655180 | |
AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
FBS | Gibco | 45015 | |
Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
IMDM | Gibco | 12440053 | |
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
Tri reagent | Sigma | T9424 | |
Triton | Sigma | T8787-50ML | |
Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
β-ME | G Biosciences | BC98 |