Kanserlerde Yaygın Genetik Olmayan TranskripsiyonEl Uzaması Defektlerini (TEkesinlikle)Incelemek için Kronik CDK9 İnhibisyonu Bir Murine Hücre Hattı Tabanlı Modeli
Summary
Protokol, genetik olmayan kusurlu transkripsiyon uzaması için in vitro murine karsinom modelini ayrıntılarıyla anlatır. Burada, CDK9 kronik inhibisyonu taklit etmek ve klinik olarak aşırı TEkesinlikle fenomen çalışma pro-inflamatuar yanıt genleri boyunca RNA Pol II üretken uzama bastırmak için kullanılır, tüm kanser türlerinin yaklaşık% 20 mevcut.
Abstract
Daha önce kanserlerin bir alt kümesi mRNA transkripsiyon uzaması (TE) yaygın eksiklikleri ile küresel transkripsiyonel deregülasyon ile tanımlanır bildirdik-biz TEkesinliklegibi kanserler diyoruz . Özellikle, TEkesinlikle kanserler, interferon/JAK/STAT ve TNF/NF-κB yolları gibi genlerin büyük bir kümesinde sahte transkripsiyon ve hatalı mRNA işleme ile karakterizedir ve bunların bastırılmasına yol açar. Renal hücreli karsinom ve metastatik melanom hastalarında tümörlerin TEkesinlikle alt tipi immünoterapide kötü yanıt ve sonuç ile anlamlı olarakilişkilidir. TEkesinlikle kanserleri araştırmanın önemi göz önüne alındığında-immünoterapikarşı önemli bir barikat portends gibi-Bu protokolün amacı bu yaygın, genetik olmayan çalışma için bir in vitro TEkesinlikle fare modeli kurmaktır kanserlerde transkripsiyonel anormallikler ve yeni anlayışlar kazanmak, mevcut ilaçlar için yeni kullanımlar, ya da bu tür kanserlere karşı yeni stratejiler bulmak. RNA polimeraz II’nin (RNA Pol II) C-terminal tekrar etki alanında (CTD) serin2 kalıntısının fosforilasyonunun giderilmesi için kronik flavopiridol aracılı CDK9 inhibisyonunun kullanımını ayrıntılarıyla anlatıyoruz ve RNA Pol II’nin verimli transkripsiyona salınımını baskılıyoruz. Uzama. TEkanserlerinin spesifik somatik mutasyonlar altında sınıflandırılmadığı göz önüne alındığında, farmakolojik bir model avantajlıdır ve en iyi şekilde gözlenen yaygın transkripsiyonel ve epigenetik kusurları taklit eder. Flavopiridol’un optimize edilmiş bir sublethal dozu kullanımı, transkripsiyon uzaması ve mRNA işleme kusurlarında genetik olmayan yaygın bozulmanın genelleştirilebilir bir modelini oluşturmada, klinik olarak gözlenen TE’yi yakından taklit eden tek etkili stratejidir. kesinlikle özellikleri. Bu nedenle, TE bu modelkesinlikle incelemek için kaldıraçlı olabilir, bağışıklık aracılı hücre saldırısına karşı onları sağlayan hücre özerk faktörler.
Introduction
Hemen hemen tüm aktif genlerin ekspresyonunda önemli bir hız sınırlayıcı adım RNA polimeraz II (RNA Pol II) organizatörün proksimal verimli uzama1,2duraklama geçiştir. Transkripsiyonel uzamanın epigenetik disregülasyonununTEolarak tanımlanan birden fazla insan malignitesinin ilerlemesine yardımcı olduğu göz önüne alındığında, kötü yanıt alabilen pro-inflamatuar yanıt yollarında suboptimal sinyalizasyona yol açar ve immünoterapisonucu 3, Bu protokolün kapsamlı amacı kanserlerde bu yaygın olmayan genetik transkripsiyonel anormallikleri incelemek için yararlı bir in vitro model kurmaktır. Bu ışıkta, CDK9’un kronik farmakolojik inhibisyonu transkripsiyon uzaması ve mRNA işleme kusurlarında genetik olmayan yaygın bozulmanın genelleştirilebilir bir modelini oluşturmak için etkili bir stratejidir. Kronik CDK9 inhibisyonu kullanmanın ardındaki mantık, RNA Pol II’nin C-terminal tekrar etki alanında (CTD) serin2 kalıntısının fosforilasyonunu ortadan kaldırarak RNA Pol II’nin verimli transkripsiyon uzaması için bastırılmasıdır. Ayrıca, TEkesinlikle kanserler, bizim grup tarafından daha önce açıklanan3,herhangi bir özel somatik mutasyon altında sınıflandırılır değildir. Bu nedenle, genetik olmayan (farmakolojik) bir model avantajlıdır ve en iyi onlarda gözlenen yaygın transkripsiyonel ve epigenetik kusurları taklit eder. Buradaki yöntem, minüri kanseri hücrelerinin kronik flavopiridol tedavi modelinin oluşumunu ve karakterizasyonunu ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Bu yöntem, daha uzun genomik uzunluklarla karakterize genler boyunca transkripsiyon uzaması, tnf/NF-κB ve interferon/STAT sinyalizasyonu gibi indükleyici ifadeler ile transkripsiyon uzama3,4,5. Genel olarak, transkripsiyonel uzama kusurları bu optimize edilmiş murine hücre hattı modeli-bilgimizin yeni açıklanan TEkesinlikle tümörler ilim için tek model-anti-tümör bağışıklık atağına direnç sürücüler, yararlanmak için yararlı bir sistem render ve bağışıklık aracılı hücre atağına karşı kanserlerde çekirdek transkripsiyon makinelerinde genetik olmayan kusurların güvenlik açıklarını inceleyin.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA Pol II uzama kontrolü malign hücrelerin yararına uyarıcı duyarlı gen ekspresyonunu düzenleyen belirleyici bir kol olarak ortaya çıkmıştır5,7,8. Uzama ve müteakip mRNA üretimi için organizatör-proksimal duraklama üstesinden P-TEFb9,10,11kinaz aktivitesi gerektirir. Modelimiz, tekesinlikle kanserlerde Pol I…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NCI (CA193549) ve CCHMC Araştırma İnovasyon Pilot ödülleri tarafından Kakajan Komurov ve Savunma Bakanlığı (BC150484) ödülü Navneet Singh tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü veya Savunma Bakanlığı’nın resmi görüşlerini temsil etmez. Fon layıcıların çalışmanın tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Referenzen
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
