Une méthode in situ à haut débit pour l’estimation de la ploidy nucléaire hépatocyte chez les souris
Summary
Nous présentons une méthode robuste, rentable et flexible pour mesurer les changements dans le nombre d’hépatocytes et le stratagème nucléaire dans des échantillons de tissus fixes/cryoconservés qui ne nécessitent pas de cytométrie d’écoulement. Notre approche fournit une signature puissante à l’échelle de l’échantillon de cytologie hépatique idéale pour suivre la progression des lésions hépatiques et des maladies.
Abstract
Lorsque le foie est blessé, le nombre d’hépatocytes diminue, tandis que la taille des cellules, la taille nucléaire et le stratagème augmentent. L’expansion des cellules non parenchymales telles que les cholangiocytes, les myofibroblastes, les progéniteurs et les cellules inflammatoires indiquent également des lésions hépatiques chroniques, des remodelages tissulaires et la progression de la maladie. Dans ce protocole, nous décrivons une approche simple à haut débit pour calculer les changements dans la composition cellulaire du foie qui sont associés aux dommages, aux maladies chroniques et au cancer. Nous montrons comment les informations extraites des sections tissulaires bidimensionnelles (2D) peuvent être utilisées pour quantifier et calibrer le stratagème nucléaire hépatocyte dans un échantillon et permettre à l’utilisateur de localiser des sous-ensembles de ploidy spécifiques dans le foie in situ. Notre méthode nécessite l’accès à des matériaux hépatiques fixes/congelés, à des réactifs d’immunocytochimie de base et à toute plate-forme d’imagerie à haute teneur de série standard. Il sert d’alternative puissante aux techniques standard de cytométrie de débit, qui exigent la perturbation des tissus fraîchement recueillis, la perte d’information spatiale et le biais potentiel de désagrégation.
Introduction
Les hépatocytes dans le foie de mammifères peuvent subir la cytokinesis au point mort pour produire des cellules binucléaires, et l’endoreplication d’ADN pour produire des noyaux polyploïdes contenant jusqu’à 16N de contenu d’ADN. Augmentation globale du ploidy cellulaire et nucléaire pendant le développement postnatal, le vieillissement et en réponse à divers stress cellulaires1. Le processus de polyploidisation est dynamique et réversible2, bien que sa fonction biologique précise reste floue3. L’augmentation du stratagème est associée à une capacité de prolifération réduite4, à la diversité génétique2,à l’adaptation aux blessures chroniques5 et à la protection contre le cancer6. Les altérations de ploidy d’Hépatocyte se produisent en raison du rythme circadien altéré7, et du sevrage8. Plus particulièrement, le profil de ploidy du foie est modifié par des blessures et la maladie9, et des preuves convaincantes suggèrent que des changements spécifiques de ploidy, tels que l’augmentation des noyaux de 8N ou la perte des hépatocytes de 2N, fournissent des signatures utiles pour le suivi de la maladie du foie gras non-alcoolique (NAFLD) progression3,10, ou l’impact différentiel des infections virales11.
En termes généraux, les lésions hépatiques et la régénération sont associées à une augmentation de la taille des cellules hépatocytes et de la zone nucléaire12, ainsi qu’à une réduction du nombre total d’hépatocytes, en particulier ceux dont la teneur en ADN2N est 10,,11. Les lésions parenchymales dans le foie sont également fréquemment accompagnées par l’expansion des cellules non parenchymales (NPC), y compris les myofibroblastes stromaux, les cellules inflammatoires et les cellules progénitrices bipotentes de foie. Les méthodes à haut débit qui fournissent un profil cytologique quantitatif du nombre de cellules parenchymiques et du stratagème nucléaire, tout en tenant compte des changements dans les PNJ, ont donc un potentiel considérable en tant que recherche et outils cliniques pour suivre la réponse du foie pendant les blessures et les maladies. L’analyse in situ récente convaincante des spectres de ploidy dans des échantillons humains du carcinome hépatocellulaire démontrent également que le ploidy nucléaire est considérablement augmenté dans les tumeurs et est spécifiquement amplifié dans les sous-types de tumeur plus agressifs avec la différenciation et la perte réduites de TP5313. Par conséquent, il y a une forte possibilité que les progrès méthodologiques dans l’évaluation quantitative du stratagème nucléaire aideront dans le profilage pronostique futur du cancer du foie.
Dans ce protocole, une méthodologie flexible à haut débit pour l’analyse comparative des sections des tissus hépatiques de souris est décrite, qui fournit un profilage cytométrique détaillé des nombres d’hépatocytes, la réponse de PNJ et une méthode calibré interne pour estimer le stratagème nucléaire(figure 1). Les hépatocytes se distinguent des PNJ par l’immunolabelling hépatocyte du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4MD), avant la caractérisation de la taille nucléaire et de la morphométrie nucléaire. Le « contenu minimal de l’ADN » est estimé pour tous les masques nucléaires circulaires en intégrant l’intensité moyenne hoechst 33342 (un indicateur de la densité d’ADN) avec le volume nucléaire tridimensionnel interpolé (3D). Le contenu minimal d’ADN d’Hépatocyte est alors calibré utilisant des PNJ pour générer un profil de stratagème nucléaire.
L’acquisition d’images, la segmentation nucléaire et l’analyse d’image sont effectuées à l’aide d’images à haute teneur, ce qui permet de dépister de vastes zones de sections hépatiques bidimensionnelles (2D) contenant des dizaines de milliers de cellules. Un programme écrit sur mesure est prévu pour le post-traitement automatisé des données d’analyse d’images à contenu élevé afin de produire un profil de stratagème à l’échelle de l’échantillon pour tous les noyaux hépatocytes circulaires. Ceci est effectué à l’aide d’un logiciel gratuit pour télécharger des logiciels pour calculer le ploidy nucléaire basé sur l’analyse d’image stereologique (SIA)10,11,14,15. La méthodologie SIA a été précédemment validée par cytométrie de flux comme méthode précise, quoique laborieuse, pour estimer le ploidy nucléaire hépatocyte dans le foie14, en supposant la morphologie nucléaire circulaire et une relation monotone entre la taille nucléaire et la teneur en ADN. Dans ce protocole, les deux paramètres nucléaires sont mesurés par l’évaluation de la morphométrie nucléaire et de l’étiquetage Hoechst 33342. Le calcul de la « teneur minimale en ADN » pour chaque masque nucléaire est suivi de l’étalonnage du stratagème nucléaire hépatocyte à l’aide des PNJ, qui ont une teneur connue en ADN de 2 à 4N et servent donc de contrôle interne utile.
Par rapport aux méthodes conventionnelles de cytométrie de débit16, l’approche décrite permet d’évaluer in situ le stratagème nucléaire hépatocyte et ne nécessite pas d’accès à des tissus frais ou à des méthodes de désagrégation qui peuvent biaiser les résultats et être difficiles à normaliser. Comme pour toutes les approches basées sur la SIA, les sous-classes de ploidy nucléaire sont sous-représentées par l’échantillonnage 2D en raison de la section des noyaux plus grands à l’extérieur du plan équatorial. Le profil de ploidy à l’échelle des tissus décrit également le contenu minimal de l’ADN pour tous les masques nucléaires hépatocytes circulaires, et ne fait pas directement de distinction entre les hépatocytes mononucléaires et les cellules binucléaires qui ont deux noyaux discrets (« non touchants ») du même stratagème. Cependant, la simplicité de ce protocole permet d’adapter une marge de manœuvre considérable pour tenir compte de paramètres supplémentaires tels que l’espacement internucléaire ou l’analyse du périmètre cellulaire, ce qui faciliterait l’identification des cellules binucléaires fournissant une évaluation plus détaillée de la ploidy cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une approche à haut contenu et à haut débit pour l’analyse du remodelage et de l’estimation des tissus du ploidy nucléaire hépatocyte dans le foie murin est décrite. Une fois familier avec la procédure, un utilisateur peut traiter, imager et analyser plusieurs échantillons dans une période de 3 à 5 jours, générant de grands jeux de données testables qui fournissent une signature détaillée de la santé hépatique. Compte tenu de la simplicité de la méthode de préparation de l’échantillon, ainsi qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le gouvernement espagnol MINECO subventions BFU2014-58686-P (LAN) et SAF-2017-84708-R (DJB). LAN a été soutenu par une bourse nationale MINECO Ramon y Cajal RYC-2012-11700 et plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), et FMN par un étudiant régional ValI-D de la Generalitat ACIF de Valence/2016/020. RP tient à remercier le professeur Ewa K. Paluch pour son financement. Nous remercions la Dre Alicia Martinez-Romero (service de cytométrie CIPF) pour l’aide de la plate-forme IN Cell Analyzer.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referenzen
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