Мы представляем надежный, экономичный и гибкий метод измерения изменений в количестве гепатоцитов и ядерной флоиди в фиксированных/криоконсервированных образцах тканей, которые не требуют цитометрии потока. Наш подход обеспечивает мощную выборку всей подписи цитологии печени идеально подходит для отслеживания прогрессирования травмы печени и болезни.
Когда печень повреждена, число гепатоцитов уменьшается, в то время как размер клеток, ядерный размер и ploidy увеличиваются. Расширение непаренхимальных клеток, таких как холангиоциты, миофибробласты, прародители и воспалительные клетки, также указывает на хроническое повреждение печени, ремоделирование тканей и прогрессирование болезни. В этом протоколе мы описываем простой высокопроизводительный подход к расчету изменений в клеточеском составе печени, связанных с травмами, хроническими заболеваниями и раком. Мы показываем, как информация, извлеченная из двухмерных (2D) разделов ткани может быть использована для количественной оценки и калибровки гепатоцитов ядерной ploidy в образце и позволяют пользователю найти конкретные подмножества ploidy в печени на месте. Наш метод требует доступа к фиксированной/ замороженной печени материал, основные иммуноцитохимии реагентов и любой стандартной высокой содержаниеизображения платформы. Он служит мощной альтернативой стандартным методам цитометрии потока, которые требуют нарушения свежесобранных тканей, потери пространственной информации и потенциальной предвзятости дезагрегирования.
Гепатоциты в печени млекопитающих могут пройти застопорился цитокинез для производства двухядерных клеток, и ДНК эндорепликации для производства полиплоидных ядер, содержащих до 16N содержание ДНК. Общее количество клеточных и ядерных ploidy увеличивается во время послеродового развития, старения и в ответ на различные клеточные стрессы1. Процесс полиплоидизации динамичный иобратимый 2,хотя его точная биологическая функция остаетсянеясной 3. Повышенная ploidy связана с уменьшенной пролиферативной емкостью4,генетическим разнообразием2,адаптацией к хронической травме5 и защитой от рака6. Гепатоцит ploidy изменения происходят в результате изменения циркадного ритма7, и отляги8. Наиболее примечательно, ploidy профиль печени изменяется травмы и болезни9, и убедительные доказательства свидетельствуют о том, что конкретные изменения ploidy, такие как увеличение 8N ядер или потери 2N гепатоцитов, обеспечивают полезные подписи для отслеживания безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD) прогрессии3,10, или дифференциального воздействия вирусных инфекций11.
В общих чертах, повреждение печени и регенерации связаны с увеличением размера клеток гепатоцитов и ядерной области12, вместе с сокращением общего числа гепатоцитов, особенно те, с содержанием ДНК 2N10,11. Паранхимальная травма печени также часто сопровождается расширением непаранхимальных клеток (НПК), включая стромальные миофибробласты, воспалительные клетки и бипотентные клетки-прародители печени. Высокопроизводительные методы, которые обеспечивают количественный цитологический профиль parenchymal номер клетки и ядерной ploidy, в то время как также учета изменений в NPCs, поэтому имеют значительный потенциал в качестве научных исследований и клинических инструментов для отслеживания реакции печени во время травмы и болезни. Принуждение последние на месте анализ ploidy спектра в человеческих образцах гепатоцеллюлярной карциномы также показывают, что ядерная плоида резко увеличивается в опухолях и специально усиливается в более агрессивных подтипов опухоли с уменьшенной дифференциацией и потерей TP5313. Таким образом, существует высокая вероятность того, что методологические достижения в количественной оценке ядерной плоиди помогут в будущем прогностическом профилировании рака печени.
В этом протоколе описана гибкая методика высокой пропускной связи для сравнительного анализа секций тканей печени мыши, которая обеспечивает детальное цитометрическое профилирование числа гепатоцитов, ответ NPC и внутренне откалиброванный метод оценки ядерной флоидии(рисунок 1). Гепатоциты отличаются от НПК иммуномаркировкой гепатоцитов 4 альфа (HNF4) до характеристики ядерного размера и ядерной морфометрии. “Минимальное содержание ДНК” оценивается для всех круговых ядерных масок путем интеграции средней интенсивности Hoechst 33342 (прокси для плотности ДНК) с интерполированным трехмерным (3D) ядерным объемом. Гепатоцитминимальное содержание ДНК затем откалибровано с помощью NPC для создания ядерного профиля ploidy.
Приобретение изображений, ядерная сегментация и анализ изображений выполняются с использованием изображений с высоким содержанием, что позволяет обсуливать большие участки двумерных (2D) секций печени, содержащих десятки тысяч клеток. Предусмотрена специально написанная программа для автоматической пост-обработки данных анализа изображений высокого содержания для получения профиля флоиди для всех круговых ядер гепатоцитов. Это выполняется с помощью бесплатного скачать программное обеспечение для расчета ядерной ploidy на основе стерилологического анализа изображений (SIA)10,11,14,15. Методология SIA была ранее подтверждена цитометрией потока как точный, хотя и трудоемкий, метод для оценки гепатоцитов ядерной флоиди и в печени14, предполагая круговую ядерную морфологию и монотоническую связь между ядерным размером и содержанием ДНК. В этом протоколе оба ядерных параметра измеряются путем оценки ядерной морфометрии и маркировки Hoechst 33342. Расчет «минимального содержания ДНК» для каждой ядерной маски сопровождается калибровкой гепатоцитной ядерной флоиды с использованием NPC, которые имеют известное содержание ДНК 2х4N и поэтому служат полезным внутренним контролем.
По сравнению с обычными методами цитометрии потока16 описанный подход позволяет оценивать ядерную флуиду гепатоцитов на месте и не требует доступа к свежим тканям или методам дезагрегирования, которые могут предусмотреть результаты и быть трудно стандартизированными. Как и во всех подходах, основанных на SIA, подклассы ядерных ploidy sgt;2N недопредставлены 2D-выборкой из-за секции больших ядер за пределами экваториальной плоскости. Профиль флоиди по всей ткани также описывает минимальное содержание ДНК для всех круглых гепатоцитов ядерных масок и не проводит прямой различать моноядерные гепатоциты и двухядерные клетки, которые имеют два дискретных (“не прикосновения”) ядра одной и той же флоиди. Однако простота этого протокола позволяет адаптировать его к дополнительным параметрам, таким как межядерное расстояние или анализ периметра ячейки, что облегчит идентификацию двухядерных ячеек, обеспечивающих более детальную оценку клеточной плоиды.
Описан высокопосевной, высокопроизводительный подход к анализу ремоделирования тканей и оценке гепатоцитов ядерной флоиди в печени мурин. После того, как пользователь ознакомился с процедурой, пользователь может обрабатывать, изображения и анализировать несколько образцов в течени?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована испанским правительством MINECO гранты BFU2014-58686-P (LAN) и SAF-2017-84708-R (DJB). LAN была поддержана национальным MINECO Рамон у Cajal стипендий RYC-2012-11700 и план GenT награду (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), и FMN регионального ValI-D студентов Валенсии Generalitat ACIF/2016/020. РП хотела бы отметить профессора Эву К. Палух за финансирование. Мы благодарим д-ра Алисию Мартинес-Ромеро (CIPF Cytometry service) за помощь в платформе IN Cell Analyzer.
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |