Высокой пропускной способ в Ситу Метод оценки гепатоцитов ядерной плоиди у мышей
Summary
Мы представляем надежный, экономичный и гибкий метод измерения изменений в количестве гепатоцитов и ядерной флоиди в фиксированных/криоконсервированных образцах тканей, которые не требуют цитометрии потока. Наш подход обеспечивает мощную выборку всей подписи цитологии печени идеально подходит для отслеживания прогрессирования травмы печени и болезни.
Abstract
Когда печень повреждена, число гепатоцитов уменьшается, в то время как размер клеток, ядерный размер и ploidy увеличиваются. Расширение непаренхимальных клеток, таких как холангиоциты, миофибробласты, прародители и воспалительные клетки, также указывает на хроническое повреждение печени, ремоделирование тканей и прогрессирование болезни. В этом протоколе мы описываем простой высокопроизводительный подход к расчету изменений в клеточеском составе печени, связанных с травмами, хроническими заболеваниями и раком. Мы показываем, как информация, извлеченная из двухмерных (2D) разделов ткани может быть использована для количественной оценки и калибровки гепатоцитов ядерной ploidy в образце и позволяют пользователю найти конкретные подмножества ploidy в печени на месте. Наш метод требует доступа к фиксированной/ замороженной печени материал, основные иммуноцитохимии реагентов и любой стандартной высокой содержаниеизображения платформы. Он служит мощной альтернативой стандартным методам цитометрии потока, которые требуют нарушения свежесобранных тканей, потери пространственной информации и потенциальной предвзятости дезагрегирования.
Introduction
Гепатоциты в печени млекопитающих могут пройти застопорился цитокинез для производства двухядерных клеток, и ДНК эндорепликации для производства полиплоидных ядер, содержащих до 16N содержание ДНК. Общее количество клеточных и ядерных ploidy увеличивается во время послеродового развития, старения и в ответ на различные клеточные стрессы1. Процесс полиплоидизации динамичный иобратимый 2,хотя его точная биологическая функция остаетсянеясной 3. Повышенная ploidy связана с уменьшенной пролиферативной емкостью4,генетическим разнообразием2,адаптацией к хронической травме5 и защитой от рака6. Гепатоцит ploidy изменения происходят в результате изменения циркадного ритма7, и отляги8. Наиболее примечательно, ploidy профиль печени изменяется травмы и болезни9, и убедительные доказательства свидетельствуют о том, что конкретные изменения ploidy, такие как увеличение 8N ядер или потери 2N гепатоцитов, обеспечивают полезные подписи для отслеживания безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD) прогрессии3,10, или дифференциального воздействия вирусных инфекций11.
В общих чертах, повреждение печени и регенерации связаны с увеличением размера клеток гепатоцитов и ядерной области12, вместе с сокращением общего числа гепатоцитов, особенно те, с содержанием ДНК 2N10,11. Паранхимальная травма печени также часто сопровождается расширением непаранхимальных клеток (НПК), включая стромальные миофибробласты, воспалительные клетки и бипотентные клетки-прародители печени. Высокопроизводительные методы, которые обеспечивают количественный цитологический профиль parenchymal номер клетки и ядерной ploidy, в то время как также учета изменений в NPCs, поэтому имеют значительный потенциал в качестве научных исследований и клинических инструментов для отслеживания реакции печени во время травмы и болезни. Принуждение последние на месте анализ ploidy спектра в человеческих образцах гепатоцеллюлярной карциномы также показывают, что ядерная плоида резко увеличивается в опухолях и специально усиливается в более агрессивных подтипов опухоли с уменьшенной дифференциацией и потерей TP5313. Таким образом, существует высокая вероятность того, что методологические достижения в количественной оценке ядерной плоиди помогут в будущем прогностическом профилировании рака печени.
В этом протоколе описана гибкая методика высокой пропускной связи для сравнительного анализа секций тканей печени мыши, которая обеспечивает детальное цитометрическое профилирование числа гепатоцитов, ответ NPC и внутренне откалиброванный метод оценки ядерной флоидии(рисунок 1). Гепатоциты отличаются от НПК иммуномаркировкой гепатоцитов 4 альфа (HNF4) до характеристики ядерного размера и ядерной морфометрии. “Минимальное содержание ДНК” оценивается для всех круговых ядерных масок путем интеграции средней интенсивности Hoechst 33342 (прокси для плотности ДНК) с интерполированным трехмерным (3D) ядерным объемом. Гепатоцитминимальное содержание ДНК затем откалибровано с помощью NPC для создания ядерного профиля ploidy.
Приобретение изображений, ядерная сегментация и анализ изображений выполняются с использованием изображений с высоким содержанием, что позволяет обсуливать большие участки двумерных (2D) секций печени, содержащих десятки тысяч клеток. Предусмотрена специально написанная программа для автоматической пост-обработки данных анализа изображений высокого содержания для получения профиля флоиди для всех круговых ядер гепатоцитов. Это выполняется с помощью бесплатного скачать программное обеспечение для расчета ядерной ploidy на основе стерилологического анализа изображений (SIA)10,11,14,15. Методология SIA была ранее подтверждена цитометрией потока как точный, хотя и трудоемкий, метод для оценки гепатоцитов ядерной флоиди и в печени14, предполагая круговую ядерную морфологию и монотоническую связь между ядерным размером и содержанием ДНК. В этом протоколе оба ядерных параметра измеряются путем оценки ядерной морфометрии и маркировки Hoechst 33342. Расчет «минимального содержания ДНК» для каждой ядерной маски сопровождается калибровкой гепатоцитной ядерной флоиды с использованием NPC, которые имеют известное содержание ДНК 2х4N и поэтому служат полезным внутренним контролем.
По сравнению с обычными методами цитометрии потока16 описанный подход позволяет оценивать ядерную флуиду гепатоцитов на месте и не требует доступа к свежим тканям или методам дезагрегирования, которые могут предусмотреть результаты и быть трудно стандартизированными. Как и во всех подходах, основанных на SIA, подклассы ядерных ploidy sgt;2N недопредставлены 2D-выборкой из-за секции больших ядер за пределами экваториальной плоскости. Профиль флоиди по всей ткани также описывает минимальное содержание ДНК для всех круглых гепатоцитов ядерных масок и не проводит прямой различать моноядерные гепатоциты и двухядерные клетки, которые имеют два дискретных (“не прикосновения”) ядра одной и той же флоиди. Однако простота этого протокола позволяет адаптировать его к дополнительным параметрам, таким как межядерное расстояние или анализ периметра ячейки, что облегчит идентификацию двухядерных ячеек, обеспечивающих более детальную оценку клеточной плоиды.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан высокопосевной, высокопроизводительный подход к анализу ремоделирования тканей и оценке гепатоцитов ядерной флоиди в печени мурин. После того, как пользователь ознакомился с процедурой, пользователь может обрабатывать, изображения и анализировать несколько образцов в течени?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована испанским правительством MINECO гранты BFU2014-58686-P (LAN) и SAF-2017-84708-R (DJB). LAN была поддержана национальным MINECO Рамон у Cajal стипендий RYC-2012-11700 и план GenT награду (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), и FMN регионального ValI-D студентов Валенсии Generalitat ACIF/2016/020. РП хотела бы отметить профессора Эву К. Палух за финансирование. Мы благодарим д-ра Алисию Мартинес-Ромеро (CIPF Cytometry service) за помощь в платформе IN Cell Analyzer.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referenzen
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
