超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析
Summary
免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。ここでは、研究設定で広く使用できるように、この実験方法の紹介です。
Abstract
グリコミックスは、疾患感受性、創薬、精密医療のための次世代バイオマーカーの発見に大きな可能性を秘めた、オミックスシステム研究の新しいサブスペシャリティです。代替IgG N-グリカンは、いくつかの一般的な慢性疾患で報告されており、臨床応用に大きな可能性を有することが示唆されている(すなわち、疾患の診断および予測のためのバイオマーカー)。IgG N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)の方法を用いて広く特徴付けられている。UPLCは、再現性と高い相対定量精度を備えた安定した検出技術です。さらに、IgG N-グリカンの構造が明確に分離され、血漿中のグリカン組成と相対的な存在量が特徴です。
Introduction
ヒトタンパク質のN-グリコシル化は、一般的かつ必須の翻訳後修飾1であり、比較的正確に疾患の発生および発症を予測するのに役立ち得る。その構造の複雑さのために、5,000以上のグリカン構造があり、疾患の診断および予測バイオマーカーとして大きな可能性を提供することが期待される2.免疫グロブリンG(IgG)に結合したN−グリカンは、IgGの機能に必須であることが示されており、IgG N-グリコシル化は、プロおよび抗炎症系3との間のバランスに関与する。微分IgG N-グリコシル化は、疾患の発症および進行に関与し、疾患病理に関与する素因および機能機構の両方を表す。IgG N-グリコシル化の炎症役割は、老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌4に関連している。
検出技術の開発に伴い、 以下の方法は、高スループットグリコミクスで最も広く使用されています:蛍光性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC-FLR)、レーザー誘導蛍光検出による多重キャピラリーゲル電気泳動 (xCGE-LIF)、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化時間質量分析(MALDI-TOF-MS)、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法(LC-ESI-MS).これらの方法は、低フラックス、不安定な結果、および低感度特異性の以前の欠点を克服しています5,6.
UPLCは、IgG N-グリコシル化と特定の疾患(すなわち、老化7、肥満8、脂質異常症9、II型糖尿病10、高血圧11、虚血性脳卒中12、およびパーキンソン病13)との関連を探索するために広く使用されている。上記の他の3つの方法と比較して、UPLCは以下の利点を有する5、14である。まず、相対的な定量分析方法を提供し、総面積正規化を伴うデータ分析により、各サンプルの比較性が向上します。第二に、機器のコストと必要な専門知識は比較的低いため、グリコシル化バイオマーカーの実装と臨床応用への変換が容易になります。ここでは UPLC の概要を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLCは相対定量分析方法5、15として機能する。この結果は、UPLCが再現性と相対的な定量精度を備えた安定した検出技術であることを示しています。各ピークのグリカンの量は、UPLCを使用して総統合領域のパーセンテージとして表されます。相対定量は、試験サンプルの比較性を向上させます。さらに、96ウェルタンパク質Gプレートを使用して、一?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(81673247&81872682)とオーストラリア・中国共同補助金(NH&MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020)からの助成金によって支援されました。
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Referenzen
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