الوقت الفاصل بين التصوير 2D من النشاط Phagocytic في M1 الضامة-4T1 الفئران سرطان الثدي خلايا في الثقافات المشتركة
Summary
الضامة النشاط البالع ضد الخلايا السرطانية, علي وجه التحديد 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا, كانت في هذه الدراسة. تم تاسيس نموذج الاستزراع الخلوي الحي وملاحظته باستخدام مزيج من المجهر الفلوري وتباين التداخل التفاضلي. وكان هذا التقييم باستخدام برامج التصوير لتطوير الفيديو الفاصلة الزمنيه متعددة.
Abstract
وقد تم تحديد الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كعنصر هام لنمو الورم ، والغزو ، الانبثاث ، والمقاومة لعلاجات السرطان. ومع ذلك ، الضامة المرتبطة بالورم يمكن ان تكون ضاره للورم اعتمادا علي البيئة المجهرية الورم ويمكن ان يغير بشكل عكسي خصائصها الظاهرية عن طريق اما معاداه النشاط السام للخلايا من الخلايا المناعية أو تعزيز الاستجابة المضادة للورم. الإجراءات الجزيئية من الضامة وتفاعلاتها مع الخلايا السرطانية (علي سبيل المثال ، كثرة الكريات) لم تدرس علي نطاق واسع. ولذلك ، فان التفاعل بين الخلايا المناعية (M1/M2-النوع الفرعي تام) والخلايا السرطانية في البيئة المجهرية الورم هو الآن بؤره البحوث العلاج المناعي للسرطان. في الدراسة الحالية ، تم تطوير نموذج الخلية الحية لزراعه الخلايا من الضامة M1 المستحثة والفئران الثديية الماوس 4T1 خليه سرطان لتقييم النشاط الضامة للبلمه باستخدام ميزه الفيديو الفاصل الزمني باستخدام التباين التدريجي ، الفلورسنت ، وتباين التداخل التفاضلي (DIC). يمكن للأسلوب الحالي مراقبه وتوثيق التصوير الخلوي الحي متعدد الخلايا لكثرة الكريات. ويمكن ملاحظه كثرة الخلايا 4T1 من قبل الضامة M1 باستخدام المجهر الفلورسنت قبل تلطيخ الخلايا 4T1 مع استر كاربوكسيفلوريسسين سكاليديديل (CFSE). يصف المنشور الحالي كيفيه زراعه الضامة والخلايا السرطانية في صحن تصوير واحد ، واستقطاب الضامة M1 ، وتسجيل الاحداث متعددة النقاط من الضامة تجتاح خلايا 4T1 خلال 13 ح من الزراعة.
Introduction
الضامة هي الخط الأول من الدفاع المناعي وتلعب دورا في الاستجابات المناعية تدبير ضد مسببات الامراض والمواد الاجنبيه ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. فهي البويضات المتخصصة التي تدمر ويتخلص من الجزيئات غير المرغوب فيها في الجسم. الضامة تسهم وظائف دفاعيه مثل أزاله الخلايا الميتة والكائنات المجهرية وتجنيد الخلايا المناعية الأخرى1. الضامة يمكن التفريق إلى نوعين مختلفين ، M1 و M2 الضامة ، استجابه للإشارات البيئية2. يتم تنشيط M1-الضامة المستقطبة (اي ، الضامة المنشطة بشكل كلاسيكي) من قبل γ (ifn-γ) و lipopolysاكتشاريدس (lps) وتشارك في الاستجابة التهابيه ، وأزاله الممرض ، وندره المحببات الفعالة ، والمناعة المضادة للجراثيم3،4. الضامة M2 ترتبط ارتباطا وثيقا الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) ولها خصائص المضادة للالتهابات والورم تعزيز4.
الفندره ، المستمدة من اليونانية القديمة (phagocytosis) ، وهذا يعني “للتهام ،” (kytos) ، وهذا يعني “الخلية” ، و-osis ، وهذا يعني “عمليه”5. الفندره هي عمليه بوساطة مستقبلات حيث البالعات (بما في ذلك الضامة ، والخلايا الاحاديه ، والعدلات) قتل وابتلاع مسببات الامراض الغازية ، وتنظيف الجزيئات الاجنبيه ، وواضحة الحطام خليه ابوتوتيك. يتم العثور علي الضامة المرتبطة بالورم (tams) في سدي في الأورام المختلفة ، بما في ذلك سرطان الثدي ، ولها وظائف الموالية للورم6،7، مما ادي إلى مقاومه كثرة الكريات. لم يتم بعد فهم اليه المفصلة لندره الخلايا السرطانية بالضامة.
تقدم هذه الدراسة طريقه من خطوتين: 1) 4t1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة M1 الاستقطاب هي الخياطة ، و 2) يتم تقييم النشاط أكله من الضامة باستخدام المجهر الفيديو الخلية الحية. وقد استخدمت CFSE صبغ الفلورسنت لوصمه عار الخلايا سرطان الثدي 4T1. العلامات وصمه عار الخلايا 4T1 لتمييزها من الضامة M1 الخياطة داخل صحن التصوير واحد. RAW 264.7 الضامة المستقطبة مع LPS و IFN-γ إلى النمط الظاهري M1. لضمان الاستقطاب الكامل ، تم تنفيذ المناعي مع الأجسام المضادة لمكافحه النوس مترافقة مع FITC. وفي وقت لاحق ، تم الحصول علي سلسله متعددة من الصور الفاصلة الزمنيه لمراقبه الاحداث المتعددة ، بما في ذلك ندره المحببات ، داخل الاستزراع.
قد يؤدي الفهم الأفضل للتفاعلات بين الخلايا السرطانية والضامة إلى العلاج المناعي المحتمل للسرطان. تقدم التصوير بالخلايا الحية عرضا مفصلا لديناميكيات الخلايا في الوقت الحقيقي ، وقد استخدمت لدراسة هجره الخلايا ، والفحص الظاهري ، والمبرمج ، والسمية الخلوية8،9 في علم الأعصاب ، والبيولوجيا التنموية ، واكتشاف المخدرات. علي الرغم من ان الورم المقترح في هذه الدراسة هو سرطان الثدي ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة علي الخلايا المستهدفة المتعددة والخلايا المستجيبة المتميزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب البروتوكول الموصوف خطوتين: 1) زراعه الخلايا السرطانية الثديية الماوس 4T1 والضامة M1-المستقطبة ، و 2) تقييم النشاط الضام البلاجي باستخدام المجهر الزمني الفاصل. ويستخدم علي نطاق واسع في زراعه الخلايا الحية في كثرة الكريات واختبارات الهجرة. نموذج زراعه الخلايا الحية هنا هو بسيط, قابل للتك?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل ماليا من قبل جيران بوترا Berimpak (GBP) ، جامعه بوترا ماليزيا: 9542800. ونود ان نشكر معهد التكنولوجيا الحيوية الزراعية ، ومختبرات ماليزيا (ABI) ، ومرفق التصوير المجهري. شكر خاص لمحمد دانيال حازم للمساعدة في تحرير وتسجيل الفيديو التجريبي لهذا العمل.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Referenzen
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
